Комментарий:

Что касается наград, предоставленных двум членам совета директоров, пожалуйста, измените информацию, чтобы раскрыть сумма компенсационных расходов, признанных в течение каждого из периодов, указанных в последнем абзаце на странице F-14.

Ответ:

Мы уважительно принимаем к сведению ваш комментарий и обновили раскрытие в Примечании 9, включив в него сумму компенсационных расходов, признанных в течение каждого из упомянутых периодов.

В отношении опционов, предоставленных консультантам и лицам, не являющимся сотрудниками, раскрытых в последних двух параграфах «Гранты на замену 16 марта 2006 г.», просьба раскрыть сумму расходов на компенсацию, признанных каждый представленный период. Также раскрывайте допущения, использованные для оценки справедливой стоимости опционов на каждую дату оценки.

Ответ:

Мы уважительно приняли к сведению ваш комментарий и обновили раскрытие в Примечании 9, включив в него сумму компенсационных расходов, признанных в течение каждого представленного периода, и допущения, использованные для оценки справедливая стоимость опционов на каждую дату оценки для опционов на замену от 16 марта 2006 года.

Комментарий:

Пожалуйста, исправьте, чтобы ответить на комментарии выше, если применимо.

Ответ:

Мы с уважением принимаем к сведению ваш комментарий и внесли соответствующие поправки в форму 10-QSB от 30 июня 2006 года.

Комментарий:

Пожалуйста, исправьте, чтобы учесть комментарии выше, если применимо.

Ответ:

Мы с уважением принимаем к сведению ваш комментарий и внесли соответствующие поправки в форму 8-K / A.

Комментарий:

Мы отмечаем, что вы не пересматривали неаудированную предварительную консолидированную сокращенную финансовую отчетность, чтобы отразить операцию обмена акциями как рекапитализацию.Пожалуйста, сделай так.

Ответ:

Мы с уважением принимаем к сведению ваш комментарий и хотели бы обратить ваше внимание Примечание 11. См. Последний абзац внизу страницы 32, где мы классифицируем транзакцию как рекапитализация.

куб.см:

Марк Кляйн, Skins Inc. лечение

Электронные чернила DoS

Проводящие чернила были приготовлены путем смешивания хлопьев серебра с раствором PEDOT: PSS (дополнительный рис.1а, б). Полупроводниковые чернила, показанные на дополнительных рисунках 1c, d, и ионно-гелевые чернила также были приготовлены в виде смесей. Подробную информацию обо всех приготовлениях чернил можно найти в разделе «Методы». Процесс рисования электроники DoS показан на рис. 1a. Сначала на режущей машине (Silhouette Cameo) был изготовлен трафарет на основе каптона и прозрачной ленты (Magic Tape, 3 M) и приклеен к целевой коже. Затем чернила были нанесены на контуры трафаретов с помощью модифицированной шариковой ручки (см. Дополнительную информацию) с диаметром наконечника 1 мм (дополнительный рис.1д). Следует отметить, что кончик пера не должен касаться кожи для рисования чернил, поскольку образуется мениск, как показано на вставке на фиг. 1а. Движение пера вызывает сдвиг мениска, в результате чего чернила растекаются по поверхности кожи. Скорость волочения ~ 10 мм / с. После ~ 5 мин испарения растворителя при комнатной температуре трафарет удалялся, и оставалась тонкая сухая пленка. Если в устройстве DoS есть какие-либо недостатки, их можно исправить, нарисовав недостатки (дополнительный рис.1е).

процесс рисования электроники DoS, начинающийся с (i) прикрепления трафарета на ленту к коже (масштабная линейка 1 см), (ii) рисования устройства с помощью трафарета, модифицированной шариковой ручки и чернил (масштабная линейка 5). мм), на вставке — крупный план наконечника (масштабная линейка 1 мм), (iii) удаление трафарета (масштабная линейка 2 см) и (iv) готовое устройство после высыхания (масштабная линейка 1 см). b Пример интегрированной системы DoS, включающей резистор, транзисторы, нагреватель, EP (электрофизиологические) датчики, датчик температуры, датчик деформации и датчик увлажнения кожи, нарисованный на коже человека (шкала 5 мм).Соответствующий трафарет для проводника показан на вставке (шкала 1 см). c Достижимый межстрочный интервал с использованием трафаретов и проводящих чернил Ag-PEDOT: PSS (шкала 1 мм). d Нерастянутые (слева, масштабная линейка 1 мм) и двухосно-растянутые (справа, масштабная шкала 1 см) состояния нарисованной структуры, состоящей из Ag-PEDOT: проводящий PSS (левый квадрат) и полупроводник P3HT-NF (правый квадрат) ) чернила на ПДМС. e Скручивающие (слева) и выколачивающие (справа, шкалы 1 см) деформации нарисованной структуры токопроводящими и полупроводниковыми красками. f СЭМ-изображения чернил Ag-PEDOT: PSS, показывающие ультраконформный контакт с бороздками и выступами (слева, масштабная полоса 250 мкм) на верхней части копии кожи и поперечное сечение, показывающее микроструктуру Ag-PEDOT: PSS (справа, масштабная линейка) 20 мкм). Фиолетовый цвет указывает на копию кожи. г Гистологическое изображение чернил Ag-PEDOT: PSS на коже мышей через 48 часов (шкала 100 мкм). ч. Гистологическое изображение чернил P3HT-NF на коже мышей через 48 часов (масштабная полоса 100 мкм). i Сопротивление листа vs.растягивайте чернила Ag-PEDOT: PSS до 30% и высвобождая их. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение. j Изображения, полученные с помощью оптического микроскопа Ag-PEDOT: PSS чернила на копии кожи, растянуты до 30% (масштабные полосы 100 мкм). k Датчик DoS EP на запястье испытуемого в растянутом (вверху) и не растянутом (внизу) состояниях (шкала 5 мм).

Исследованы морфологии полученных пленок, созданных методом рисования чернилами. Изображение, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) (дополнительный рис.2) проводящих чернил показывает нано / микромасштабные чешуйки серебра, а изображения полупроводниковых чернил (дополнительный рис. 3а, b), полученные с помощью атомно-силового микроскопа (АСМ), показывают нановолокнистые структуры P3HT. Чтобы продемонстрировать универсальность платформы электроники DoS, был нарисован прототип многофункциональной интегрированной системы (рис. 1b), чтобы показать, что несколько устройств, включая транзисторы, датчик деформации, датчик температуры, нагреватель, резистор, датчик увлажнения кожи и датчики EP, могут быть изготовленным в процессе рисования.На вставке показан соответствующий трафарет для чернил Ag-PEDOT: PSS, а изготовление интегрированной системы описано далее в дополнительной информации. Интегрированная система DoS может подвергаться растяжению и сжатию без каких-либо физических повреждений, как показано на дополнительном рис. 4.

Характеристики рисования чернил, механические свойства, совместимость с кожей и электрические характеристики чернил Ag-PEDOT: PSS и P3HT-NF были оценены. Ширину чернильных линий и разрешение можно регулировать, варьируя диаметр кончика пера или используя трафареты.Ширина линии чернил Ag-PEDOT: PSS составляла ~ 1 мм, но ее можно было уменьшить до 300 мкм (дополнительный рис. 5) с помощью ручки с более тонким кончиком. Трафарет может уменьшить межстрочный интервал до 200 мкм без создания пересекающихся линий (рис. 1c). Чернила P3HT-NF и ионного геля, показанные на дополнительных рисунках 6a, b, соответственно, были нарисованы линиями, чтобы продемонстрировать способность красок писать. Было приготовлено несколько вариантов чернил Ag-PEDOT: PSS, которые сравнили, чтобы определить оптимальное соотношение 1: 2 (хлопья Ag: PEDOT: раствор PSS), как показано на дополнительном рис.7: это подробнее объясняется в разделе «Методы». Время высыхания составляло 3-5 мин (дополнительный рис. 8а). Хотя процесс рисования электроники DoS включает ручное управление, разная толщина (от нескольких сотен нм до 10 мкм) слоя чернил Ag-PEDOT: PSS может быть достигнута путем многократного рисования в одном и том же месте (дополнительный рисунок 8b). Стоит упомянуть, что перо может быть спроектировано так, чтобы обеспечить лучшее управление потоком чернил и интерфейсом чернила / кожа для обеспечения однородности и повторяемости чернил, что устраняет потенциальную проблему изменения устройства.

Чтобы проверить устойчивость чернил Ag-PEDOT: PSS и чернил P3HT-NF к различным режимам деформации, они были нанесены на полидиметилсилоксан (PDMS), показанный на рис. 1d (слева). При двухосном растяжении (~ 20%) трещины в нарисованной структуре практически отсутствуют (рис. 1г, справа). Ни скручивание, ни толчки не вызвали видимых повреждений, как показано на рис. 1e. Раскрашенное СЭМ изображение чернил Ag-PEDOT: PSS на дубликате кожи на основе PDMS (окрашено в фиолетовый цвет) показывает, что чернила заполняют и конформно ложатся на бороздки и впадины (рис.1е, слева). Вид в поперечном сечении подтверждает и показывает микроструктуру чернил Ag-PEDOT: PSS (рис. 1f, справа). Изготовление копии кожи PDMS описано в дополнительной информации.

Чтобы проверить реакцию кожи на чернила Ag-PEDOT: PSS и P3HT-NF, их наносили на спину мышей после удаления шерсти, затем образцы кожи извлекали и оценивали с помощью процедур гистологического окрашивания. По сравнению с контрольным (не обработанным чернилами) образцом кожи (дополнительный рис.9), 48-часовые образцы кожи с нанесенными чернилами Ag-PEDOT: PSS и P3HT-NF (рис. 1g, h, соответственно) не показали злокачественных новообразований или воспаления в эпидермисе или в дерме под ним. Чернила Ag-PEDOT: PSS демонстрируют низкое удельное сопротивление с сопротивлением листа 1,2 Ом / кв. Без деформации и 9,9 Ом / кв. При деформации 30% (рис. 1i). Снятие напряжения привело к уменьшению до 2,7 Ом / кв. После 1000 циклов растяжения при 10% деформации сопротивление листов краски Ag-PEDOT: PSS немного увеличилось (дополнительный рис.10). Хранение чернил Ag-PEDOT: PSS в окружающей среде (22 ° C) или в холодильнике (4 ° C) не повлияло на его стойкость в течение нескольких месяцев, как показано на дополнительном рис. 11. Изображения, полученные с помощью оптического микроскопа Ag-PEDOT: чернила PSS на подложке дубликата кожи PDMS показывают, что при деформации до 30% не наблюдалось явных трещин (рис. 1j). Следует отметить, что поверхность PDMS была сделана более гидрофильной (дополнительный рис. 12a, b) для улучшения адгезии, но эти обработки не требуются для реальных кож, поскольку они частично гидрофильны ⁹ .На рис. 1k показана морфология текстуры кожи датчика DoS EP с (верхняя рамка) и без (нижняя рамка) растяжения на коже человека, что указывает на сверхприспособленность и деформируемость устройств DoS.

Электронные устройства и датчики DoS на копии кожи

Для проверки работы электроники DoS на неровных и шероховатых поверхностях транзисторы, тензодатчики, датчики температуры и нагреватели были охарактеризованы на копиях кожи. Транзисторы, которые являются фундаментальными строительными блоками в электронных схемах и биомедицинских устройствах и системах, были изготовлены с использованием процесса рисования электроники DoS.Схема в разобранном виде DoS-транзистора, состоящего из Ag-PEDOT: чернил PSS в качестве проводника, чернил P3HT-NF в качестве полупроводника и чернил с ионным гелем в качестве диэлектрика, показана на рис. 2a. Изготовление DoS-транзистора с использованием соответствующих трафаретов (дополнительный рис. 13) подробно описано в разделе «Методы». Изображения транзистора с текстурой кожи без деформации (верхний кадр) и 30% деформации (нижний кадр) представлены на рис. 2b. Длина канала может быть порядка нескольких сотен микрон, как показано на СЭМ-изображении на рис.2c. Кривые ВАХ показывают типичные характеристики транзистора p-типа (рис. 2d). Чтобы получить кривые передачи, напряжение смещения V _DS было установлено равным -0,55 В, а напряжение затвора V _G изменялось от 0 до -3 В. Отношение включения / выключения (I _ON / I _OFF ) и подвижность (µ _FE ) были рассчитаны равными 1,69 × 10 ³ и 7,07 см ² V ^-1 с ^-1 , когда DoS-транзистор не подвергался деформации, и 2,01 × 10 ² и 5.36 см ² V ⁻¹ s ⁻¹ при 30% деформации соответственно (рис. 2д, е). Некоторый гистерезис может наблюдаться, как показано на дополнительном рис. 14, но этого можно ожидать для транзисторов с электролитическим затвором ¹⁸ . Пороговое напряжение (V _TH ) претерпело небольшое снижение от -2,38 В без деформации до -2,03 В при 30% деформации. Расчеты для µ _FE подробно описаны в дополнительном примечании 1. Хотя процесс рисования полностью выполняется вручную, эти результаты показывают, что его можно использовать для разработки функциональных и растягиваемых транзисторов DoS в качестве доказательства концепции.Транзистор DoS потенциально может использоваться в приложениях для считывания, интерфейсной электронике, усилителе сигнала или интегральных схемах.

a Схема транзистора DoS на основе Ag-PEDOT: чернила PSS в качестве проводника, чернила P3HT-NF в качестве полупроводника и ионно-гелевые чернила в качестве диэлектрика. b DoS-транзистор на копии кожи без деформации (вверху) и 30% деформации (внизу, шкала 5 мм). c СЭМ-изображение нарисованных электродов истока (S) и стока (D) и канала (шкала 100 мкм). d ВАХ транзистора DoS без приложенной деформации. e , f Передаточные кривые DoS-транзистора без деформации и 30% деформации в направлении длины канала транзистора. г Электрическое сопротивление тензодатчика DoS при приложенной механической нагрузке до 30% и соответствующие коэффициенты измерения. На вставке показана схема тензодатчика DoS.Планки погрешностей представляют стандартное отклонение. ч Изменение относительного сопротивления тензодатчика DoS при циклическом растяжении и отпускании при деформации 10% и 25%. i Изменение относительного сопротивления датчика температуры DoS при различных температурных условиях. j Схема нагревателя DoS на основе токопроводящих чернил. k Температурные профили под различным напряжением на нагревателе DoS. л Градуировочная кривая нагревателя DoS. Планки погрешностей представляют собой s.d.

Датчики деформации и датчики температуры, которые могут отображать критическую физиологическую информацию от кожи ^19,20 , были нарисованы в формате двухполюсных датчиков, как показано на вставке к рис. 2g. Оба устройства были сконструированы с использованием чернил Ag-PEDOT: PSS в качестве проводника и чернил P3HT-NF в качестве полупроводника с трафаретами, показанными на дополнительном рисунке 15. Для тензодатчика DoS статические испытания показали, что изменение сопротивления увеличилось в раз. 4 (рис. 2g) после растяжения до 30%, в то время как коэффициент калибровки оставался около 15 во время процесса растяжения.Испытание на циклическое растяжение и высвобождение на фиг. 2h показывает, что изменение сопротивления увеличилось в 2 раза при деформации 10% и в 4,5 раза при деформации 25%. Подробный расчет калибровочного коэффициента представлен в дополнительном примечании 2. Датчик температуры DoS показал, что изменение сопротивления уменьшилось с 1 до 0,57 в диапазоне температур 20–45 ° C (рис. 2i). Реакция датчика температуры DoS аналогична реакции термистора с отрицательным температурным коэффициентом (NTC). На основе линейного графика зависимости ln (R) от1000 / T, показанное на дополнительном рисунке 16, константа термистора ( β) была определена равной 2589 K, что сопоставимо с коммерческими термисторами NTC ²¹ . Расчет для β показан в дополнительном примечании 3. Ag-PEDOT: чернила PSS были нанесены на трафарет (дополнительный рис. 17) для изготовления нагревателя DoS (схематично показан на рис. 2j), который потенциально может быть использован для заживление кожных ран ^22,23 . Динамическое изменение температуры нагревателя DoS было получено путем приложения смещения постоянного тока от 1 до 7 В для получения температур в диапазоне от 25 до 140 ° C, как показано на рис.2к. Градуировочная кривая для нагревателя DoS показана на рис. 2l.

Электронные устройства и датчики DoS на коже

Чернила Ag-PEDOT: PSS использовались для создания нагревателя, соединения для RC-цепи, датчика увлажнения кожи и датчиков EP на коже свиньи и человека. Изображения с инфракрасной камеры (FLIRONE Pro, FLIR® Systems, Inc.) нагревателя DoS показывают высокую проводимость чернил на шероховатой и неровной поверхности свиной кожи (рис. 3a). Чтобы продемонстрировать другое использование чернил на коже, электронные компоненты были объединены в RC-цепь со светодиодом и соединены проводом с чернилами Ag-PEDOT: PSS в качестве межсоединения (рис.3б, слева). Конденсатор (C = 2200 мкФ) заряжался от батареи (V _b = 9 В), подключенной к схеме, показанной на вставке к рис. 3c. После извлечения батареи конденсатор разрядил ток через остальную часть цепи, который протекал через резистор (R = 800 Ом) и включил светодиод (рис. 3b, справа). Обычные медицинские датчики были также изготовлены с использованием чернил Ag-PEDOT: PSS.

a Изображения с ИК-камеры нагревателя DoS на коже без приложенного напряжения (слева) и с приложенным напряжением 5 В (справа, масштабная линейка 1 см). b Ag-PEDOT: чернила PSS, служащие связующим звеном во время зарядки конденсатора (слева) и разряда через резистор и светодиод (справа, шкала 2 см). c Напряжение конденсатора, показывающее зарядку до извлечения аккумулятора, а затем разрядку. На вставке — принципиальная схема, показывающая батарею, подключенную к конденсатору, который подключен к резистору и светодиоду, подключенным последовательно. d Датчик увлажнения кожи DoS на коже без (слева) и с приложенной деформацией (справа, шкала 2 мм). e Калибровка датчика степени увлажнения кожи с использованием коммерческого измерителя влажности. f Импеданс датчика увлажнения кожи DoS без механического растяжения и с ним. Стрелка указывает время нанесения лосьона на сухую кожу. г Датчики DoS EP без (вверху) и с приложенной деформацией (внизу, шкала 2 мм). ч Записанные сигналы ЭМГ без (вверху) и с приложенной деформацией (внизу). i Записанные сигналы ЭКГ без (вверху) и с механическим растяжением (внизу). j Схема компонентов цепи беспроводной передачи, установленных на кронштейне и взаимодействующих с датчиками DoS EP (шкала 2 см). k Среднее количество ударов в минуту по всем испытаниям, полученное на основе сигналов ЭКГ, полученных с помощью датчиков DoS EP. До появления красной пунктирной линии субъект неподвижно стоял. После красной пунктирной линии субъект двинулся вперед.

Датчик гидратации кожи DoS был сконструирован в виде двух встречно-штыревых электродов с соответствующим трафаретом (дополнительный рис.18) для регистрации импеданса кожи, на основании которого можно экстраполировать уровень гидратации эпидермиса и дермы. Перемыкание обеспечивает большее взаимодействие между двумя электродами и увеличенную емкостную чувствительность ²⁴ . Текстурированная кожа поверхность датчика гидратации кожи DoS может быть четко видна в его ненатянутом (рис. 3d, слева) и растянутом (рис. 3d, справа) состояниях. Линейная зависимость, показанная на рис. 3e ( R ² = 0,997) между измерениями коммерческого измерителя гидратации (единицы% гидратации) и показаниями нарисованного датчика гидратации кожи (емкость, единицы нФ), может быть записана как

, где % H — процент увлажнения кожи, C — измеренная емкость, b — наклон и a — калибровочная константа.После нанесения лосьона на кожу сопротивление резко снизилось ²⁵ , указывая на то, что датчик гидратации кожи DoS может обнаруживать изменение гидратации кожи даже при растяжении (рис. 3f). Дополнительные данные импеданса, детали интерфейса и процедура измерения показаны на дополнительном рис. 19a – f и описаны далее в дополнительном примечании 4. Чернила Ag-PEDOT: PSS также служили в качестве жизнеспособного датчика EP, изображенного на рис. 3g в нерастянутые (вверху) и растянутые (внизу) состояния.Датчики DoS EP, нарисованные в соответствующих местах с использованием трафаретов (дополнительный рис. 20), могут захватывать электромиографические (ЭМГ) и ЭКГ-сигналы, как показано на рис. 3h, i, соответственно. Для получения ЭМГ два датчика EP были нарисованы на предплечье и бицепсе одной руки (дополнительный рис. 21a). Для регистрации сигналов ЭКГ на каждом запястье пациента был нарисован один датчик EP (дополнительный рисунок 21b), а затем подключен к системе сбора данных (DAQ). Более подробная информация в разделе «Методы».Отношение сигнал / шум (SNR) сигналов ЭКГ, записанных с помощью электродов DoS, остается примерно таким же (~ 45 дБ) даже после растяжения. Подробности расчета SNR для сигналов ЭКГ приведены в дополнительном примечании 5, а спектральная плотность мощности сигнала показана на дополнительном рисунке 22. Кроме того, датчики и устройства DoS могут быть инкапсулированы (дополнительный рисунок 23a, b) для защиты от влажных сред и при этом сохраняют свои функции, такие как запись ЭКГ (дополнительный рис.23c). Важно отметить, что все сигналы EP, показанные в этой работе, не подвергались постобработке. Как было показано с предыдущими датчиками, датчики EP работают на коже даже при напряжении, без видимых изменений в полученных сигналах.

Беспроводной мониторинг ЭКГ с электроникой DoS

Полностью портативный мониторинг сигнала EP позволяет использовать электронику DoS в реальных и клинических условиях. Датчики DoS EP были сопряжены со специальной схемой беспроводной передачи данных, схематически показанной на рис.3j. Подробная информация о настройке и интерфейсе находится в разделе «Методы» и показана на дополнительном рис. 24a – c. Поскольку ходьба считается одним из наиболее репрезентативных повседневных занятий и является частью клинических стресс-тестов ^26,27,28 , субъекту было предложено остановиться в течение 16 секунд и отдохнуть, а затем пройти 16 секунд (вставка рис. 3j) для простого стресс-теста. Можно наблюдать очевидное снижение ЧСС (на рис. 3k), когда испытуемый стоял на месте и расслабился (средняя ЧСС составляла 91,5 ударов в минуту), но затем она увеличивалась (средняя ЧСС составляла 95.1 уд. / Мин.) Во время ходьбы испытуемого. Дополнительные сведения об эксперименте и обработке находятся в разделе «Методы». Обнаружение изменения ЧСС указывает на то, что датчики DoS EP подходят для диагностики сердца. Кроме того, репрезентативное испытание данных ЭКГ, записанных во время теста, показано на дополнительном рисунке 25a, b, на котором показаны различимые подволны P, QRS и T даже во время ходьбы, что означает возможность беспроводной системы мониторинга DoS EP для достаточного захвата ЭКГ. сигналы при регулярной деятельности и клинических обследованиях.

Сравнение электроники DoS с существующими технологиями

Чтобы определить преимущества датчиков DoS EP среди существующих сенсорных технологий, они сравнивались как с гелевыми электродами для больниц (Meditrace 450 Foam Electrodes, Kendall), так и с ультратонкими (толщиной 350 нм). ) электроды из змеевидной сетки за их эффективность в присутствии пота, долговечность во времени, адгезию к коже и устойчивость к артефактам движения. Подробные сведения о тестах на пот, долговечность и адгезию описаны в разделе «Методы».Электроды DoS были изготовлены, как упоминалось ранее. Гелевые электроды больничного класса помещали на кожу без каких-либо изменений. Сетчатые электроды были спроектированы и изготовлены с использованием технологий микротехнологии (дополнительная информация, схематически показанная на дополнительном рисунке 26), а подробный геометрический дизайн и схема интерфейса с кожей показаны на дополнительном рисунке 27 и дополнительном рисунке 28 соответственно. На запястьях испытуемого рисовали / помещали по два датчика каждого типа для записи ЭКГ.Сигналы ЭКГ, полученные с помощью датчиков DoS EP, сопоставимы с сигналами других типов датчиков до потоотделения (рис. 4a – c, в середине). Сигналы ЭКГ, зарегистрированные во время потоотделения с помощью датчиков DoS EP и сетчатых электродов, оставались относительно согласованными с сигналами, записанными до потоотделения, в отличие от сигналов, записанных с помощью гелевых электродов (рис. 4a – c, справа). В частности, для гелевых электродов наблюдался ослабленный сигнал ЭКГ, который является результатом скопления пота или снижения концентрации ионов в гелевом электролите ^29,30 .Потоотделение минимально повлияло на внешний вид датчика DoS EP, как показано на дополнительном рисунке 29. SNR датчиков до и во время потоотделения (дополнительная таблица 1) показывает, что датчики DoS EP и сетчатые электроды показывают небольшие изменения (~ 1 дБ ). Однако отношение сигнал / шум гелевых электродов после потоотделения уменьшилось на ~ 3 дБ, что совпадает с заметным уменьшением амплитуды. Кроме того, все три типа датчиков были оценены на предмет их долговечности в течение 7 часов. Сигналы ЭКГ, полученные с помощью датчиков DoS EP, были относительно согласованными во всех временных точках измерения, в отличие от других датчиков (дополнительный рис.30а – в).

датчик DoS EP (слева, шкала 2 мм) с сигналами ЭКГ, записанными до потоотделения (в центре) и во время потоотделения (справа). b Гелевый электрод (слева, шкала 1 см) с сигналами ЭКГ, записанными до потоотделения (в центре) и во время потоотделения (справа). c Сетчатый электрод (слева, шкала 5 мм) с сигналами ЭКГ, записанными до потоотделения (в центре) и во время потоотделения (справа).

Адгезия датчиков к коже была также проверена с помощью тестов на отслаивание и трение. Как показано на дополнительном рис. 31a – e, датчик DoS EP не может быть удален с кожи, в то время как другие были легко удалены. Датчики DoS EP остались нетронутыми при сильном трении, в то время как сетчатые электроды были необратимо повреждены (дополнительный рис. 32a, b, соответственно). Любые недостатки устройств DoS могут быть быстро исправлены, как упоминалось ранее, тогда как для поврежденных сетчатых электродов потребуется совершенно новое устройство.

ЭП-зондирование без артефактов движения на коже человека

Артефакты движения особенно проблематичны при мониторинге состояния носимых устройств и приводят к неправильной интерпретации и ошибочным диагнозам, что имеет серьезные последствия для здоровья ^31,32 . Исследования показали, что неправильный диагноз из-за артефактов движения может существенно снизить качество жизни пациентов ^33,34 . Артефакты, возникающие из-за нарушений между электродом и кожей, возникают из-за неправильного прилегания электрода к коже во время движения ^6,7,35 .Чтобы оценить реакцию трех типов датчиков на индуцированные движения, было проведено два эксперимента, включая локальную деформацию кожи при записи сигналов ЭКГ и вибрацию руки при записи сигналов ЭМГ в состоянии покоя. Следует отметить, что любые очевидные отклонения от формы волны синусовой ЭКГ во время деформации или потенциалов ЭМГ покоя во время вибрации в каждом из соответствующих экспериментов рассматривались как артефакты движения.

Чтобы проверить реакцию трех типов датчиков на деформацию кожи, ЭКГ человека записывалась с регулярными интервалами растяжения, сжатия и высвобождения кожи в месте расположения одного из датчиков для каждого типа датчика. .Та же самая установка проводного сбора данных (дополнительный рисунок 33a) использовалась, как упоминалось ранее, а пример деформации показан на дополнительном рисунке 33b. Более подробная информация в разделе «Методы». Следует отметить, что такой способ деформации кожи под электродом был крайним вариантом деформаций, которые кожа испытывает при повседневных движениях.

Типичные испытания деформации кожи при записи ЭКГ с помощью датчиков DoS EP, гелевых электродов и сетчатых электродов показаны на рис.5а – в соответственно. Интересующие области выделены соответствующими цветами оранжевого, синего и зеленого цветов, причем каждый цвет представляет движения растяжения, сжатия и освобождения соответственно (рис. 5a). Как показано на рис. 5а, сигнал, регистрируемый датчиками DoS EP во время движений, не показывает никаких аномальных отклонений от формы волны синусовой ЭКГ. Гелевые электроды показывают, что деформации иногда искажали сигнал (красные стрелки на рис. 5б). Эти артефакты, вероятно, возникли из-за скольжения на границе раздела гель-электролит-кожа, вызванного приложенной вручную деформацией кожи ^36,37 .Сетчатые электроды также показывают флуктуации сигнала во время деформаций (красные стрелки на рис. 5c). Скольжение между сетчатым электродом и кожей во время деформаций происходило из-за непостоянного прилегания сетчатого электрода к коже ⁵ . Эти данные трех типов датчиков в увеличенном масштабе представлены на дополнительных рисунках. 34–36 соответственно. Значения SNR были рассчитаны для сигналов, показанных в средних кадрах рис. 5a – c, и были определены как 50 дБ, 20 дБ и 12 дБ для датчиков DoS EP, гелевых и сетчатых электродов, соответственно.Дополнительный рис. 37a, b показывает, как шум и артефакты были изолированы для гелевого и сетчатого электродов, соответственно, а дальнейшее описание приведено в дополнительном примечании 6. Очевидно, артефакты шума и движения могут существенно повлиять на SNR. Результаты для датчиков DoS EP были дополнительно проверены с помощью специального устройства для растяжения для воспроизводимых деформаций кожи (дополнительный рис. 38a, b). Подробности представлены в дополнительной информации. Как и ожидалось, в сигналах ЭКГ не наблюдалось никаких артефактов во время деформаций, создаваемых изготовленным на заказ устройством для растяжения (дополнительный рис.39а, б).

a Записанные сигналы ЭКГ (в центре) от датчиков DoS EP во время локального цикла растяжения / отпускания (слева) и цикла сжатия / отпускания (справа). Оранжевые полоски указывают продолжительность растягивающего движения, синие полоски указывают продолжительность сжимающего движения, а зеленые полоски указывают продолжительность расслабляющего движения. b Записанные сигналы ЭКГ (в центре) от гелевых электродов во время цикла локального растяжения / отпускания (слева) и цикла сжатия / отпускания (справа).Красные стрелки указывают на артефакты. c Записанные сигналы ЭКГ (в центре) от сетчатых электродов во время цикла локального растяжения / отпускания (слева) и цикла сжатия / отпускания (справа). Красные стрелки указывают на артефакты. d ЭМГ-сигналы в состоянии покоя, записанные при движении руки, вызванном вибрацией. Розовые полоски указывают продолжительность времени, в течение которого виртуальная машина была включена для датчиков DoS EP (вверху), гелевых электродов (в центре) и сетчатых (внизу) электродов. e TF карты сигналов ЭМГ в состоянии покоя с движением, вызванным вибрацией, для датчиков DoS EP (вверху), гелевых электродов (в центре) и сетчатых (внизу) электродов.Розовые полоски и красные линии показывают продолжительность колебаний.

Помимо характеристики сигналов ЭКГ во время деформаций кожи, было оценено изменение импеданса кожи к электроду (SEI) во время деформаций, поскольку оно было связано с артефактами движения ³⁸ . Дополнительный рис. 40a иллюстрирует принципиальную схему установки, которая была адаптирована для получения изменений SEI ^39,40 . В дополнительном примечании 7 приведены подробные сведения об установке и параметрах эксперимента.Кроме того, импеданс (и сопротивление), нормированный по площади контакта, показан в дополнительной таблице 1. Величина изменения SEI (показанная на дополнительном рис. 40b – d) во время всех деформаций, включая растяжение, сжатие и освобождение, была определена как составлять 138 ± 41,5 Ом, 54,1 ± 13,2 Ом и 1,81 ± 1,44 кОм для датчиков DoS EP, гелевых и сетчатых электродов соответственно. Статистический анализ (дополнительное примечание 7) не показал значительной разницы ( P = 0,99) между средним изменением SEI для датчиков DoS EP и гелевых электродов.Эти данные показывают, что изменение SEI для датчиков DoS EP и гелевых электродов не оказало существенного влияния на результаты, показанные на рис. 5a – c. Кроме того, были получены изменения импеданса на поверхности датчика во время растяжения и высвобождения на коже человека (дополнительный рисунок 40e). Дополнительное примечание 7 содержит подробную информацию об экспериментальной установке. Изменение импеданса во время деформаций было минимальным на различных частотах измерения, относящихся к мониторингу сигнала EP ^41,42 , что делает датчики DoS EP хорошо подходящими для регистрации биологических сигналов при наличии деформаций кожи.

Другие исследования, в которых изучали происхождение артефактов движения, вызванных движениями в направлении z или в направлении, перпендикулярном поверхности кожи, путем присоединения вибрационного двигателя (VM) рядом с датчиком для имитации движения руки ^{7 , 43,44,45} . Поскольку было показано, что более тонкие датчики менее восприимчивы к артефактам движения ⁷ , а датчики DoS EP могут иметь толщину всего несколько 100 нм, реакция датчиков DoS EP на движение, вызванное вибрацией (схема показана на дополнительном рис. .41). Также были оценены характеристики гелевого и сетчатого электродов, подробности см. В разделе «Методы». Судя по сигналам ЭМГ покоя во временной области (рис. 5d), датчики DoS EP (вверху) и гелевые электроды (посередине) не показывают очевидной восприимчивости к вибрации, тогда как сетчатые электроды (внизу) подвержены значительному воздействию. Хотя сетка была ультратонкой, более высокая амплитуда вибрации могла создавать артефакты, которые могли быть захвачены на участках электродов ⁷ .Увеличенные изображения сигналов во временной области в состояниях включения и выключения VM на дополнительном рис. 42a – d предполагают, что датчики DoS EP и гелевые электроды не подвержены влиянию этой вибрации. Однако дальнейший анализ в частотно-временной области выявил информацию, которую нельзя было наблюдать только по сигналам временной области.

Карты время-частота (TF) на рис. 5e были построены для анализа частотных составляющих сигналов. ЭМГ-сигналы в состоянии покоя (<250 Гц), обозначенные желтым (20 дБ) цветом, можно увидеть на всех картах TF всех датчиков.Сетчатые электроды (внизу) подверглись прямому воздействию вибрации, что обозначено зеленым (представляющим от -10 до -20 дБ) цветом около 1 кГц. Хотя VM вибрировал с частотой 1 кГц, во время вибрации было существенное присутствие сигналов более низкой частоты (> 250 и <500 Гц) по всему исследуемому спектру, что показано на карте TF для сетчатых электродов. Это более низкое частотное содержание также преобладает на карте TF для гелевых электродов, когда VM включен, и четко различимо по сравнению с тем, когда VM выключен, что указывает на то, что гелевые электроды действительно были восприимчивы к вибрации.В отличие от гелевого и сетчатого электродов, датчики DoS EP не показывают этот артефакт в частотно-временной области, как это видно на соответствующей карте TF (рис. 5e, вверху). Следует отметить, что всплески сигналов, наблюдаемые при включении и выключении виртуальной машины, не рассматривались как артефакты, вызванные вибрацией. Дальнейшие эксперименты подтвердили результаты для датчиков DoS EP. Ни увеличение амплитуды вибрации виртуальной машины, ни перемещение виртуальной машины ближе к датчикам DoS EP не приводили к появлению артефактов в записанных сигналах ЭМГ, как показано на дополнительном рис.43a – e.

Ускоренное заживление кожных ран с помощью электроники DoS

Как упоминалось ранее, простота процесса рисования электроники DoS делает технологическую платформу подходящей для областей с ограниченными ресурсами. Еще одно очевидное преимущество заключается в том, что электроды DoS можно настроить под любую форму и размер раны. Например, солдаты на поле боя часто получают ранения кожи от осколков ⁴⁶ , на полное заживление которых может уйти от нескольких дней до месяцев. Было показано, что применение импульсной электрической стимуляции для заживления кожных ран ускоряет заживление ран, особенно в фазах пролиферации и ремоделирования ^22,47,48,49 .Была использована модель раны на коже мышей, и электрическая стимуляция с помощью электроники DoS показала ускоренное заживление ран. На спине мышей хирургическим путем была создана кожная рана ( N = 3), и электроды были протянуты вокруг верхней половины раны, как показано на фиг. 6a, b, соответственно. Схема стимуляции схематически показана на дополнительном рис. 44, а подробные сведения об эксперименте можно найти в разделе «Методы». Гистологические изображения показывают, что на обработанной половине не видно корки (рис.6c, вверху), хотя визуальное наблюдение на глаз позволило предположить наличие тонкого слоя струпа. На необработанной половине видна большая струпья (рис. 6c, внизу), в отличие от обработанной стороны, которая указала на более медленное естественное заживление. Гистологические изображения также показывают, что поперечное сечение обработанной половины имело более узкую ширину раны (указана черными стрелками), чем у необработанной половины. Дополнительно измеряли ширину раны (струпа) на 1, 3 и 5 дни. Ширина струпа уменьшилась с 1 см до 0.49 см (необработанная) и до 0,20 (обработанная) к 5-му дню, что явно демонстрирует ускоренное заживление для обработанной половины (рис. 6d). Подключение миниатюрного стимулятора постоянного тока к электронике DoS было бы чрезвычайно выгодным для лечения на ходу. Ускоренные результаты заживления ран подчеркивают производительность и настраиваемость электроники DoS для лечения.

a Экспериментальная установка, демонстрирующая электроды DoS вокруг кожной раны на спине мышей ( N = 3).Электроды DoS служили проводящими путями для электростимуляции (шкала 2 см). b Фотографии заживления ран на 1-й день (слева), 3-й день (в центре) и 5-й день (справа). Верхнюю половину раны обрабатывали электростимуляцией, а нижнюю половину оставляли без лечения и заживали естественным путем (масштабная шкала 1 см). c Гистологические изображения обработанной (вверху, масштабная линейка 100 мкм) и необработанной (внизу, масштабная линейка 250 мкм) половин раны на 5-й день. Черные стрелки указывают ширину раны. d Ширина корки с течением времени для обработанной (черной) и необработанной (красной) половин раны.

Супрамолекулярная биомиметическая кожа, сочетающая в себе широкий спектр механических свойств и множественные сенсорные возможности

Приготовление гидрогелей

Супрамолекулярные полиэлектролитные гидрогели были легко получены путем статистической сополимеризации акриловой кислоты (АК) и 3-диметил (метакрилоил) аммония сульфонат (DMAPS) (рис. 1а) без химических сшивок и набухающий в водных растворах NaCl.В отличие от прочных гидрогелей, состоящих из полиамфолитов, которые требуют строгого баланса заряда в процессе сополимеризации ²³ , этот тип цвиттерионных полиэлектролитных гидрогелей может быть синтезирован в широком диапазоне концентраций мономеров, соотношений и ионной силы. И их механические свойства могут регулироваться этими факторами, как показано на дополнительных рисунках. 1–3. Чтобы обеспечить надежность и избежать образования пузырьков в гидрогелях, здесь мы выбрали образец с начальной концентрацией мономера 45% и массовым соотношением мономеров (AA: DMAPS) 4: 1 для дальнейших характеристик.

Подтверждение множественных динамических взаимодействий в супрамолекулярных сетях. a Химическая структура полиэлектролита (PAA-co-DMAPS), синтезированного в данной работе. b Спектры НПВО-Фурье (в области 1800–1000 см ^–1 ) лиофилизированного сополимера ПАК-со-ДМАПС и супрамолекулярных полиэлектролитных гидрогелей, уравновешенных в D ₂ O с различными концентрациями NaCl и их соответствующие кривые второй производной. c Гидродинамические диаметры лиофилизированного сополимера ПАК-со-ДМАПС в водных растворах (0,1 мас.%) С различными концентрациями NaCl (0, 0,1, 0,5 и 1 М). На вставке фото показано, что в 1 М NaCl наблюдаются осадки. d Фотография сополимера ПАК-со-ДМАПС, уравновешенного в водных растворах (0,1 мас.%) С различными концентрациями NaCl. e Объемные отношения набухания полиэлектролитных гидрогелей, уравновешенных в водных растворах NaCl с различными концентрациями.(планки погрешностей: стандартные отклонения). f Соответствующая фотография гидрогелей в e

Множественные динамические сшивки в супрамолекулярных сетях

Во-первых, мы даем представление о множественных динамических сшивках внутри супрамолекулярных полиэлектролитных гидрогелей с помощью инфракрасных спектров, динамического светорассеяния (DLS) , и измерения набухания. Как показано на рис. 1b, по сравнению с лиофилизированным сополимером ПАК-со-ДМАПС, полосы валентных колебаний С = О ПАК и ПДМАПС смещаются в сторону более низких частот (1701–1709 см ^–1 ) во всех полиэлектролитных гидрогелях ( D ₂ O вместо H ₂ O использовали в качестве растворителя для устранения перекрытия H ₂ O примерно при 1640 см ( ^-1 ).Они указывают на водородные связи между неионизированным –COOH, а также на ионные ассоциации между –COO ^– и четвертичными аммониевыми группами ²⁴ , в то время как полосы симметричных валентных колебаний SO ₃ ^– смещаются в сторону более высоких частот, от 1038 см ⁻¹ в лиофилизированном сополимере до 1042 см ^-1 в гидрогелях, что указывает на гидратацию SO ₃ ^— и увеличение ионных ассоциаций между SO ₃ ^— и группами четвертичного аммония ²⁵ .

Помимо водородных связей и ионных ассоциаций, добавление NaCl увеличивает гидрофобные взаимодействия, что демонстрируется агрегацией сополимера PAA-co-DMAPS (рис. 1c, d) ²⁶ , меньшее соотношение объема набухания (рис. 1e) , f) и более высокая кажущаяся энергия активации E _a (дополнительные рисунки 4–7) супрамолекулярных полиэлектролитных сеток с повышенной ионной силой. Гидродинамические диаметры линейных сополимеров ПАК-со-ДМАПС (полученных диссоциацией надмолекулярных сеток) увеличиваются с добавлением NaCl, и осадки наблюдаются в 1, 2, 4 и 6 М растворах NaCl (рис.1в, г). Более того, возрастающие гидрофобные взаимодействия приводят к более высоким энергетическим барьерам движения цепи и, таким образом, усиливают динамически сшитые сети с меньшими объемными отношениями набухания (Рис. 1e, f). Согласно кривым наложения время-температура ²⁷ , E _a вычисляется как 41 кДж моль ^-1 в полиэлектролитных гидрогелях без NaCl и увеличивается до 59, 66 и 96 кДж моль ^-1 , когда гидрогели уравновешиваются в 2, 4 и 6 М растворах NaCl соответственно.

Широкий спектр механических свойств

Супрамолекулярные сети с разными энергетическими барьерами демонстрируют разные зависящие от времени механические свойства. При колебательной деформации 0,5% гидрогель, уравновешенный 4 M NaCl, демонстрирует уникальное вязкоупругое поведение с переходом между упругостью и вязкостью около 10 ⁻³ Гц при комнатной температуре (рис. 2a), что указывает на то, что гидрогель сочетает в себе эластичность, подобную твердому телу. и жидкоподобная пластичность в различных временных масштабах.Следовательно, предварительно приготовленный супрамолекулярный гидрогель может быть реконфигурирован для изготовления тонкого слоя прозрачной гидрогелевой кожи для протеза руки (коэффициент пропускания около 90% в видимом диапазоне длин волн, дополнительный рисунок 8). Прозрачная гидрогелевая кожа демонстрирует способность к изменению формы, адаптируясь к неровным поверхностям, а также соответствует движению протезного пальца (рис. 2b). Эта превосходная способность к изменению формы или реконфигурации подобна некоторым естественным существам, что важно для будущих приложений роботов с мягким телом, но никогда не было достигнуто в предыдущих биомиметических шкурах.Дополнительный фильм 1 записывает широкий спектр механических свойств гидрогеля в режиме реального времени. Он не только демонстрирует упругую эластичность при нажатии пальцев и чрезвычайно высокую растяжимость, но также способен изменять свою форму и очень быстро залечивать трещины.

Вязкоупругость, способность к реконфигурации, податливость и автономное самовосстановление динамических супрамолекулярных сетей. a Частотно-зависимые модули накопления ( G ’) и потери ( G ”) супрамолекулярного полиэлектролитного гидрогеля (массовое соотношение мономеров AA: DMAPS составляет 4: 1, уравновешенное в 4 M NaCl). b Фотография прозрачного гидрогеля в исходном состоянии; он изменен, чтобы адаптироваться к неровным поверхностям протеза руки, и показывает соответствие движению протезного пальца (масштабная линейка: 2 см). c Прямое наблюдение реконфигурации и автономного самовосстановления динамических сетей с помощью флуоресцентных микроскопических изображений с временным разрешением (масштабная шкала: 20 мкм). Белые стрелки указывают на цепочки в динамических сетях, пересекающих трещину. d Схематическое изображение динамического процесса

Чтобы непосредственно наблюдать реконфигурацию и самовосстановление супрамолекулярных полиэлектролитных сеток, мы пометили разрушенный гидрогель родамином.Флуоресцентные микроскопические изображения гидрогеля показывают взаимосвязанную пористую структуру (фиг. 2c), что соответствует изображению лиофилизированного образца, полученному с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM) (дополнительный рисунок 9). Мы проследили движение разорванных сетей по изображениям с временным разрешением. Как показано на рис. 2c, когда время увеличивается, динамические водородные связи и ионные ассоциации притягивают цепи, чтобы взаимно диффундировать через трещину и вступать в новые поперечные связи. Этот динамический процесс согласуется с прогнозирующей моделью автономного самовосстановления, основанной на обратимых ассоциациях ²⁸ .Как схематически показано на рис. 2d, наряду с релаксацией цепи, диссоциированные группы имеют тенденцию реформировать мосты и, таким образом, восстанавливать сети.

Количественные характеристики механических свойств этого супрамолекулярного полиэлектролитного гидрогеля представлены на дополнительных рисунках. 10–12. Он устойчив к сжатию с модулем сжатия 27,6 кПа (дополнительный рис. 10), что сравнимо с химически сшитыми гидрогелями и натуральной кожей. Самовосстановление в микроскопическом масштабе также оценивается с помощью реологических измерений ступенчатой ​​деформации.Этот гидрогель может немедленно восстановить 78,5% G ’, а самовосстановление можно циклически повторять несколько раз (дополнительный рисунок 11). Что касается измерений растяжения, как первичный, так и самовосстанавливающийся гидрогель (в течение 2 часов) демонстрирует удивительно большое удлинение> 100 без перелома, что указывает на эффективность заживления почти до 100% в течение 2 часов (дополнительный рисунок 12).

Далее мы сравниваем механические свойства этого гидрогеля и сообщенных быстрых самовосстанавливающихся гидрогелей (в течение 2 часов).Как показано на дополнительном рис. 13, стоит отметить, что с улучшением растяжимости модуль упругости обычно уменьшается. Например, хотя гидрогели на основе 2-уреидо-4-пиримидона могут растягиваться до 10 000%, их модуль упругости меньше 5 кПа ²² . Устройства на основе гидрогеля с таким низким модулем могут быть слишком слабыми, чтобы противостоять внешним изменениям. В целом, этот гидрогель сочетает в себе прочную эластичность, чрезвычайно большую растяжимость и быстрое автономное самовосстановление, а также простой одноэтапный метод подготовки.Об этой комбинации редко сообщалось в предыдущих работах, и она является преимуществом для разработки экономически эффективной ионной электроники скин-подобного типа, адаптируемой к сложной среде.

Кроме того, этот супрамолекулярный полиэлектролитный гидрогель подлежит вторичной переработке. Как показано на дополнительном рис. 14, даже если гидрогель дегидратируется, он может восстановить> 90% G ’за несколько циклов дегидратации-гидратации.

Множественные сенсорные возможности ионной электроники на основе гидрогеля

Мобильные ионы в супрамолекулярном полиэлектролитном гидрогеле не только улучшают механические характеристики, но также обеспечивают ионную проводимость для передачи информации в ионтронике на основе гидрогеля.Чтобы воссоздать множественные сенсорные возможности, здесь диэлектрический эластомер (VHB 4905, 3M) зажат между двумя ионно-проводящими слоями гидрогеля, которые соединены с тремя металлическими электродами. Таким образом, сэндвич-конфигурация включает емкостный датчик с параллельными пластинами (между электродами 1 и 2) и ионно-резистивный датчик (между электродами 2 и 3) для имитации различных рецепторов стимулов в естественной коже (рис. 3a). Когда биомиметическая оболочка растягивается при разных температурах, емкость параллельных пластин нечувствительна к колебаниям температуры и демонстрирует почти линейную зависимость между изменением емкости и деформацией растяжения (рис.3b, c) ⁹ , тогда как резистивные сигналы чувствительны к температуре и могут быть описаны как гиперплоскость в пространстве «изменение сопротивления в зависимости от деформации в зависимости от температуры» (рис. 3d). Следовательно, емкостный датчик действует как механорецептор натуральной кожи, а резистивный датчик действует как композитный (термический и механический) рецептор. Когда биомиметическая кожа стимулируется как напряжением, так и температурой в сложной среде, емкостный датчик («механорецептор») может различать стимулы напряжения (рис.3b, c), а изменение температуры может быть получено из резистивной гиперплоскости.

Деформационные и температурные ощущения биомиметической кожи. a Схематическое изображение и две упрощенные эквивалентные электрические схемы биомиметической кожи. b Емкостная реакция биомиметической кожи на взаимное влияние напряжения и температуры. c Кривая емкости-деформации биомиметической кожи. Данные получены из средних значений емкости при различных температурах в b , а полосы ошибок (стандартные отклонения) очень малы, что свидетельствует о нечувствительности емкостного отклика к изменению температуры. d Резистивная реакция биомиметической кожи на взаимное влияние напряжения и температуры. e Кривые обратимой емкости-деформации и теоретический прогноз (красная пунктирная линия). f Обратимые кривые сопротивления деформации и теоретический прогноз (красная пунктирная линия). г Обратимые кривые зависимости сопротивления от температуры. ч Циклические кривые зависимости деформации от емкости в диапазоне деформации 0–100%. i Циклические кривые сопротивления – деформации в диапазоне деформаций 0–100%. j Кривые изменения сопротивления и температуры в диапазоне температур 10–50 ° C

Зависимости между деформацией, температурой, емкостью и сопротивлением также предсказуемы. Предполагая, что диэлектрическая проницаемость и объем остаются постоянными при деформации биомиметической кожи ⁹ , когда она растягивается в λ раз, емкость C следует линейной зависимости C = C ₀ λ и ионное сопротивление R масштабируются как R = R ₀ λ ² (рис.3e, f, C ₀ , R ₀ — начальная емкость и сопротивление, соответственно, более подробная информация доступна в дополнительной информации, дополнительный рисунок 15). Более того, подобно зависимости сопротивления от температуры, обнаруженной в ионных жидкостях ²⁹ и электронных проводниках ³⁰ , ионное сопротивление гидрогеля уменьшается с повышением температуры окружающей среды (рис. 3g). По сравнению с ранее описанными кожевенными термодатчиками на основе металлов ³¹ , самовосстанавливающихся эластомеров ³⁰ , электропроводящих полимеров ³² , нанокомпозитов ^33,34 и т. Д., эта биомиметическая кожа не только демонстрирует относительно высокую чувствительность, но также имеет широкий диапазон температурной чувствительности (дополнительный рис. 16).

Помимо измерения деформации и температуры, эта биомиметическая кожа также может воспринимать напряжение сжатия из-за изменений геометрии (дополнительный рис. 17a). Когда он сжимается по толщине, его емкостная область соответственно увеличивается и приводит к увеличению емкости (дополнительный рис. 17b). Между тем, сопротивление слоя гидрогеля также увеличивается с уменьшением площади поперечного сечения и удлинения по длине (дополнительный рис.17в). Примечательно, что при приложении напряжения сжатия емкость C и ионное сопротивление R синхронно увеличиваются в 1/ k раз, что отличается от соотношения между деформацией растяжения, емкостью и сопротивлением (подробнее о теоретические прогнозы и экспериментальные данные доступны в дополнительной информации).

Непрерывные циклические тесты (рис. 3h – j) и ступенчатые изменения (дополнительный рис. 18) деформации и температуры подтверждают надежность этого биомиметического кожного покрова.Дальнейшая оценка длительной стабильности. Хотя этот гидрогель может изменять свою форму в динамических условиях, он довольно стабилен в статическом состоянии. Когда устройство на основе гидрогеля помещается в замкнутую среду (без испарения воды или защиты эластомера, подобного эпидермису, дополнительный рисунок 19), в течение 12 часов наблюдается незначительный дрейф (<2%) емкостных и резистивных сигналов. Когда гидрогель подвергается воздействию типичной среды обитания (относительная влажность 60%, 25 ° C), он может сохранять относительно стабильную ионную проводимость в течение 4 часов (дополнительный рис.20а). Хотя длительная дегидратация снижает ионную проводимость, ксерогель полиэлектролита все еще имеет ионную проводимость около 2 × 10 ⁻⁵ См · см ⁻¹ через 20 дней. Следовательно, обезвоженное устройство поддерживает термочувствительное сопротивление (дополнительный рисунок 20b) и стабильные емкостные сигналы (дополнительный рисунок 20c). Вдохновленные структурой кожи млекопитающих, люди могут вводить некоторые эпидермисоподобные эластомеры для защиты этой надмолекулярной кожи ^9,35 (дополнительный рис.21) или рециркулировать его из обратимого процесса дегидратации-гидратации (дополнительные рисунки 14 и 22).

Применение в качестве типа многофункциональной биомиметической кожи

Когда биомиметическая кожа прикрепляется к протезу пальца с помощью эпидермисоподобной ленты VHB (рис. 4a), она позволяет протезному пальцу ощущать напряжение и температурные стимулы через различные раздражители-рецепторы, т. е. емкостные и резистивные датчики соответственно. Например, он может записывать информацию о сгибании-выпрямлении пальца на основе изменений емкости во время деформации (рис.4b, дополнительный фильм 2). Когда рука человека касается протеза пальца, биомиметическая кожа также может ощущать повышение температуры с уменьшением сопротивления в реальном времени (рис. 4c, дополнительный фильм 3). В соответствии с соотношением сопротивления и температуры около комнатной температуры, температура увеличивается примерно на 0,3 ° C, что примерно соответствует среднему изменению температуры, определенному на инфракрасном изображении протеза руки, сделанном сразу после удаления руки человека (рис.4г).

Применения для измерения деформации и температуры и самовосстановления биомиметической кожи. a Фотография биомиметической кожи, прикрепленной к протезу пальца с помощью лент VHB. b Емкостные сигналы отслеживают движения пальцев. Фотография на вставке взята из дополнительного фильма 2. c Резистивные сигналы, когда рука человека касается протеза пальца. Фото-вставка взято из Дополнительного фильма 3. d Инфракрасное изображение протеза руки после удаления руки человека. e Фотография биомиметической кожи, слой гидрогеля которой разрезан пополам. f Фотография биомиметической кожи после самовосстановления. г Сопротивление и емкость биомиметической кожи до перелома и после самовосстановления. h Изменения емкости биомиметической кожи до перелома и после самовосстановления, когда он применяется для обнаружения сгибательно-выпрямляющего движения протеза пальца (емкость увеличивается, когда палец сгибается, и уменьшается, когда он выпрямляется).(Шкала: 2 см)

Помимо ощущения напряжения и температуры, эта биомиметическая кожа обладает такой же способностью к самовосстановлению, как и натуральная кожа. Когда слой ионно-проводящего гидрогеля биомиметической кожи разрезан пополам (рис. 4e), он может автономно восстанавливать трещину после соприкосновения (рис. 4f). В течение 20 минут ионное сопротивление и емкость могут быть восстановлены только с дрейфом примерно 0,04 и 0,9% соответственно (рис. 4g). Самовосстанавливающаяся биомиметическая кожа способна обнаруживать движение пальца и показывает аналогичные изменения емкости до перелома и после самовосстановления (рис.4ч). Кроме того, зависимости емкости-деформации, сопротивления-деформации и сопротивления-температуры восстанавливаются по мере самовосстановления ионно-проводящего гидрогеля (дополнительный рис. 23). Однако, если промышленный диэлектрический слой также поврежден, восстановление биомиметической оболочки будет ограничено эффективностью заживления диэлектрического слоя. Поскольку здесь ленты VHB могут склеиваться после разрезания пополам, ионное сопротивление и емкость также могут восстанавливаться в течение 20 минут (дополнительный рис.24).

Всесторонние характеристики этой биомиметической кожи сравниваются с характеристиками натуральной кожи и других искусственных кож на дополнительном рисунке 25. Эта платформа сочетает в себе широкий спектр механических свойств и множественные ощущения, которые редко были достигнуты в предыдущих работах, например, типичные искусственные кожи на основе растяжимого кремния ⁵ , полиакриламидных гидрогелей ⁹ и самовосстанавливающихся эластомеров ³⁶ .

Кожа как эндокринный орган

Дерматоэндокринол.2009 сентябрь-октябрь; 1 (5): 250–252.

Христос С. Зубулис

¹ Отделения дерматологии, венерологии, аллергологии и иммунологии; Медицинский центр Дессау; Дессау, Германия

² Лаборатория биогеронтологии, дерматофармакологии и дермато-эндокринологии; Институт клинической фармакологии и токсикологии; Charité Universitaetsmedizin Berlin; Берлин, Германия

¹ Отделения дерматологии, венерологии, аллергологии и иммунологии; Медицинский центр Дессау; Дессау, Германия

² Лаборатория биогеронтологии, дерматофармакологии и дермато-эндокринологии; Институт клинической фармакологии и токсикологии; Charité Universitaetsmedizin Berlin; Берлин, Германия

Поступила в редакцию 16 января 2009 г .; Принято 13 июля 2009 г.

Abstract

Путем определения новых видов биологической активности гормонов и их разнообразия в отношении различных типов клеток кожи стало очевидно, что сама кожа обладает способностью вырабатывать несколько гормонов и веществ с гормоноподобной активностью. Эти вещества, по-видимому, действуют через паракринные, аутокринные, внутрикринные и эндокринные механизмы, выполняя свои плейотропные эффекты.Также новым является знание о том, что кожа может метаболизировать гормоны и производить производные с потенциально системной активностью. Эти результаты указывают на новые концепции в нашем понимании роли кожи и ее гормонов как важных игроков в гомеостазе и нарушениях всего человеческого организма. Наконец, ученые, работающие в области дермато-эндокринологии, ожидают, что в их деятельности будут использоваться фармакологические и терапевтические функции гормональных медиаторов, их рецепторов и антагонистов.Последняя идея уже реализована для кортикостероидов, андрогенов, эстрогенов, аналогов витамина D для местного применения и ретиноидов, которые сегодня занимают прочное место в клинической дерматологии.

Ключевые слова: кожа, человек, гормон, дерматология, эндокринология, физиология кожи

Кожа и гормоны

Историческая картина эндокринной системы как совокупности определенных органов, вырабатывающих гормоны, в настоящее время заменена концепцией организованные сообщества органов, в которых клетки излучают, получают и координируют молекулярные сигналы от удаленных источников, таких как установленные эндокринные органы, их соседей и самих себя ().Сложные эндокринные механизмы, такие как экспрессия и функция рецепторов определенных гормонов, синтез гормонов из основных классов соединений, используемых организмом для общих целей, устранение гормонов в специализированных клетках кожи и проявление биологической активности, также были идентифицированы в кожа. ¹

Режимы действия гормона. Классические и современные эндокринные функции: гормоны, вырабатываемые установленными эндокринными органами или другими удаленными источниками, соответственно, достигают тканей-мишеней через кровообращение.Паракринная функция: гормоны действуют локально на клетки, отличные от тех, которые их производят. Функция юкстакрина: гормоны, вырабатываемые в одной клетке, напрямую взаимодействуют с рецептором соседней клетки. Аутокринная функция: гормоны действуют на клетки, в которых они вырабатываются. Внутрикринная функция: гормоны активируются в клетке, в которой они вырабатываются, и действуют на нее, связываясь с ядерными рецепторами.

Несмотря на эти знания, внимание к способности кожи человека удовлетворять текущим требованиям функций эндокринного органа было обращено только недавно. ^{2 — 5} Кожа человека классически считалась мишенью для нескольких гормонов, действие которых давно признано и в некоторых случаях хорошо охарактеризовано. Например, волосяные фолликулы и сальные железы являются мишенями для андрогенных стероидов, секретируемых гонадами и корой надпочечников. ^{6 , 7} Кроме того, гормоны играют важную роль в развитии и физиологической функции тканей кожи человека, ^{8 , 9} и, кроме того, гормоны также производятся в коже.Например, циркулирующие андрогены дегидроэпиандростерон (DHEA) и андростендион превращаются в коже различными путями в тестостерон или андростендион, а на периферии — в более мощный андроген 5α-дигидротестостерон (5α-DHT). ^{10 , 11} Таким образом, с современной дермато-эндокринологической точки зрения кожа является не только приемником сигналов от удаленных передатчиков, но и эндокринным органом. ^{12 , 13} В последние годы быстро накопились новые знания об экспрессии и функции специфических рецепторов гормонов, ¹⁴ синтез гормонов из основных классов соединений, используемых организмом для общих целей, ¹⁵ организованный метаболизм, ^{10 , 11} активация, инактивация и устранение гормонов в специализированных клетках кожи, ¹⁶ проявление биологической активности, ^{7 , 17} и высвобождение тканевых гормонов в тираж. ^{15 , 17}

Рецепторы гормонов в коже человека

Гормоны оказывают свое биологическое действие на клетки кожи посредством связывания и взаимодействия с рецепторами высокой аффинности. Кожа человека экспрессирует рецепторы пептидных гормонов и нейротрансмиттеров, которые в основном расположены на поверхности клетки, а также рецепторы стероидных и тироидных гормонов, которые находятся в цитоплазме или ядерных компартментах. ^{1 , 7 , 15 , 18 — 20}

Гормональная активность на коже человека

Гормоны проявляют плейотропно-биологические эффекты кожи , аутокринные, внутрикринные и эндокринные механизмы. ^{1 , 12} В частности, гормон роста / инсулиноподобный фактор роста-1, нейропептиды, половые стероиды, глюкокортикоиды, ретиноиды, витамин D, лиганды рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом, и эйкозаноиды являются основными примерами гормонов, действующих на кожа. ^{1 , 14}

Синтез гормонов в коже человека

Кожа человека вырабатывает гормоны, которые выделяются в кровоток и важны для функций всего человеческого организма. ²¹ Основными примерами являются половые стероиды, тогда как большая часть андрогенов и эстрогенов у мужчин и женщин синтезируется локально в периферических тканях-мишенях из неактивных предшественников надпочечников DHEA и андростендиона. ^{10 , 11 , 16} DHEA и андростендион превращаются в тестостерон или в 5α-DHT различными путями за счет участия трех изотипов внутриклеточного фермента 5α-редуктазы и изотипов 17β. -гидроксистероиддегидрогеназа, ^{11 , 16} , таким образом делая кожу ответственной за значительные количества циркулирующих уровней 5α-DHT.Наилучшая оценка внутрикринного образования эстрогенов в периферических тканях у женщин составляет порядка 75% до менопаузы и близка к 100% после менопаузы, за исключением небольшого вклада тестостерона и андростендиона в яичниках и / или надпочечниках. ¹² Таким образом, у женщин в постменопаузе почти все активные половые стероиды вырабатываются в тканях-мишенях по внутрикринному механизму.

Более того, уровни сообщений белка-3, связывающего инсулиноподобный фактор роста (IGF), выше в коже, чем в печени, а концентрации циркулирующего IGF-связывающего белка-3 значительно увеличиваются гормоном роста и IGF-1. ²² GH выполняет прямую функцию в регуляции синтеза IGF-связывающего белка-3, а реакция уровней мРНК IGF-связывающего белка-3 в коже как на GH, так и на IGF-I предполагает, что дермальные фибробласты могут быть более важными, чем печень в регуляции циркулирующего резервуара IGF-связывающего белка-3 при определенных обстоятельствах.

Наконец, что не менее важно, кожа человека вырабатывает гормоны, которые выделяются в кровоток и имеют постоянное значение для функций всего человеческого организма, такие как витамин D. ¹⁵ Кожа является уникальным местом синтеза холекальциферола, ^{23 , 24} , который является производным холестерина. Эпидермальные кератиноциты содержат механизмы, необходимые для производства кальцитриола и рецептора витамина D. ^{15 , 25}

Активация и инактивация гормонов в коже человека

Помимо способности вырабатывать гормоны, кожа человека способна метаболизировать гормоны, чтобы активировать и инактивировать их.Эти шаги в большинстве случаев согласованно выполняются различными популяциями клеток кожи, что указывает на эндокринную автономию кожи. Характерными примерами этого вида эндокринной функции кожи являются метаболические пути оси кортикотропин-высвобождающий гормон / пропиомеланокортин, половые стероиды, витамин D и ретиноиды. ^{1 , 15 , 26}

Сопутствующие заболевания

Сердечно-сосудистые заболевания, вызванные атеросклерозом, являющиеся наиболее частой причиной смертности и заболеваемости в западном мире, напрямую связаны с нарушениями липидного обмена. сахарный диабет и инсулинорезистентность.Нарушения функции щитовидной железы и метаболизма порфиринов возникают реже, но могут вызвать опасные для жизни ситуации, если их не распознать. Все эти, по крайней мере частично, эндокринологические нарушения связаны с характерными дерматозами, которые должны позволять раннюю диагностику и значимое вмешательство. ^{27 — 30} Дерматоэндокринология кажется шире, чем думают даже те, кто является инициатором этой области.

Эндокринологически активные соединения

Лечение кожных заболеваний с помощью гормональных медиаторов, их рецепторов и антагонистов является распространенной процедурой в дерматологии.Кортикостероиды, андрогены, эстрогены, аналоги витамина D для местного применения и ретиноиды сегодня занимают прочное место в дерматофармакологии. ^{13 , 15 , 18}

Кожные болезни и проявления, связанные с сахарным диабетом. (а) атрофия кожи, (б) опрелость, вызванная кандидозом, (в) склеромикседема Арндта-Готтрона, (г) диабетический буллез, (д) ​​липоидный некробиоз, (е) черный акантоз, (ж) диссеминированная гранулема, (з) буллезная геморрагическая рожа (i) некроз периферических сосудов (гангрена).

Список литературы

Полностью мягкий мультиаксиальный датчик силы на основе жидкого металла для электронной кожи | Письма Micro and Nano Systems

Для исследования реакции многоосного датчика силы был реализован трехосевой датчик нагрузки (SM-50 N, CAS Korea) для мониторинга силы, приложенной к датчику в направлениях x, y и z. и линейный столик с нагружающим наконечником для нагружения с управляемым смещением (рис.4a) Каждый микроканал LM был подключен к 8-канальному считывателю АЦП (ADS1114, Texas Instruments), установленному на Arduino DUE (Arduino). Микроканалы LM были обозначены как x1, x2, x3 и x4, как показано на рис. 4b. В исходном состоянии (F = 0) напряжение составляет примерно 20 мВ, а соответствующее ему сопротивление составляет примерно 0,4 Ом из-за высокой электропроводности жидкого металла. Благодаря схеме деления напряжения и считывателю АЦП с высоким разрешением можно было отслеживать небольшие изменения напряжения.

Характеристики производительности. a Экспериментальная установка. b Схематический вид датчика. (x1 – x4: метки для каждого микроканала LM, H : высота купола и D : диаметр купола) c Отклик датчика с высотой купола ( H ) 0,9 мм до нормальная направленная сила. d Реакция в реальном времени на различные нагрузки e Отклик датчика, когда H составляет 2,2 мм. f Чувствительность к смещению в зависимости от высоты купола

В купольном датчике положения внутренней пары микроканалов LM и внешней пары геометрически симметричны, соответственно.(x2 и x3: внутренняя пара, x1 и x4: внешняя пара). Таким образом, реакции сенсоров каждой пары на приложенную нормальную силу показали аналогичную тенденцию. Когда была приложена нормальная сила 1,2 Н, относительные изменения напряжения (ΔV / V ₀ ) внутренней пары увеличились до 12,1 и 15,8 соответственно. С другой стороны, ответы x1 и x4 внешней пары были только 0,4 и 0,8 соответственно (рис. 4c). Это означает, что разработанные многоосные датчики силы могут различать направление приложенной силы, используя различное положение микроканала LM путем изменения геометрии купола.Кроме того, отклики датчиков восстанавливались до исходных значений после различных циклов нагружения благодаря превосходной стабильности жидкого металла и конструкции датчика (рис. 4d). Между тем, когда высота купола ( H ) увеличилась до 2,2 мм, пара внешних датчиков показала несколько иные ответы: отклик x1 начал увеличиваться после 0,5 N, а ответ x4 увеличился после 1 N (рис. 4e. ). Это связано с разным зазором между микроканалами LM вдоль купола.

Кривые сила-смещение в зависимости от разной высоты купола были измерены для проверки чувствительности датчика. Когда H увеличивается, меньшая сила прилагается при том же смещении, и чувствительность датчика уменьшается (рис. 4f). Например, для приложения нормальной силы 1 Н требуется смещение 200 мкм для высоты купола H = 0,9 мм, а смещение 900 мкм требуется для H = 2,2 мм. Когда сила, приложенная к датчику без куполообразной конструкции ( H = 0 мм), отклик резко возрастает с увеличением нагрузки.По мере увеличения H требуется большее смещение для приложения силы. Кроме того, купол с увеличенным размером H обеспечивает большее радиальное смещение между соседними каналами, что приводит к различному поведению отклика матрицы датчиков. Эти характеристики приводят к разнице в чувствительности мультиаксиального датчика относительно высоты и диаметра купола. Кроме того, диаметр купола также повлияет на зазор между каналами для жидкого металла, хотя в нашем исследовании это не рассматривается.

Характеристики разработанного датчика исследовались на плоских поверхностях, где возможен точный контроль направления и величины силы. С другой стороны, когда датчик расположен на изогнутых или волнистых поверхностях, тенденция или поведение датчика будет другим, поскольку микроканалы деформируются, что требует дополнительной калибровки исходного состояния. Определение характеристик датчика на поверхности с различной геометрией выходит за рамки данного исследования и остается в качестве будущей работы для практического применения электронной кожи.

Оценка пребиотических свойств кожуры миндаля (Amygdalus communis L.) in vitro | Письма о микробиологии FEMS

Аннотация

В этом исследовании мы исследовали потенциальный пребиотический эффект натуральной (NS) и бланшированной (BS) кожуры миндаля, которая является побочным продуктом промышленности по переработке миндаля. Была использована полная модель желудочно-кишечного тракта, включая in vitro, желудочное и двенадцатиперстное пищеварение с последующей ферментацией в толстой кишке с использованием смешанных фекальных бактериальных культур.И NS, и BS значительно увеличили популяцию бифидобактерий и Clostridium coccoides / Eubacterium rectale , что привело к получению пребиотического индекса (3,2 для BS и 3,3 для NS), который хорошо сравнивался с коммерческими пребиотическими фруктоолигосахаридами (4,2) при 24-часовая инкубация. Не было обнаружено значительных различий в доле групп кишечных бактерий и в продукции короткоцепочечных жирных кислот между NS и BS, что показывает, что полифенолы, присутствующие в кожуре миндаля, не влияют на бактериальную ферментацию.В заключение мы показали, что пищевые волокна из кожуры миндаля изменили состав кишечных бактерий, а кожура миндаля, возникшая в результате промышленного бланширования, может быть использована в качестве потенциальных пребиотиков.

Введение

Кожура миндаля ( Amygdalus communis L.), как известно, обладает рядом полезных питательных свойств, в основном за счет наличия полифенолов и высокого (12%) содержания пищевых волокон (Mandalari et al. , 2010). Стенки миндальных клеток (пищевые волокна) устойчивы к расщеплению ферментов в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, и это может иметь значение для управления массой тела: липиды, не высвобождаемые при жевании, недоступны для абсорбции в кишечнике (Ellis et al., 2004; Mandalari et al. , 2008а). Физиологические свойства пищевых волокон были широко исследованы, растворимые фракции с основными эффектами на всасывание глюкозы и липидов при лечении диабета (Mann et al. , 2004), а нерастворимые фракции медленно и не полностью ферментируются в толстой кишке. , с несколькими благоприятными эффектами на функцию толстой кишки, включая привычку кишечника, транзит, метаболизм и баланс комменсальной флоры в толстой кишке (Costabile et al., 2008). Состав микробиоты толстой кишки устанавливается при рождении и сразу после него, становясь все более сложным с возрастом (Blaut et al. , 2002). Пребиотики — это пищевые продукты или пищевые ингредиенты, способные регулировать микробиоту толстой кишки и характеризующиеся их устойчивостью к кислотности желудочного сока, гидролизу ферментами млекопитающих и всасыванию в желудочно-кишечном тракте. Они ферментируются кишечной микробиотой и вызывают избирательную стимуляцию роста и / или активности кишечных бактерий, связанных со здоровьем и благополучием (Gibson & Roberfroid, 1995; Mandalari et al., 2007). Роберфроид (2007) определил пребиотик как «селективно ферментированный ингредиент, который допускает определенные изменения как в составе, так и / или активности желудочно-кишечного микробного сообщества, что приносит пользу благополучию и здоровью хозяина».

Здесь мы описываем потенциальный пребиотический эффект кожуры миндаля, используя полную модель пищеварения желудочно-кишечного тракта, которая включает среду желудка и тонкого кишечника, и модель толстой кишки, состоящую из in vitro ферментационных систем с репрезентативными кишечными бактериями человека.Кожура миндаля имеет высокое содержание клетчатки, большая часть которой нерастворима, а также значительное количество липидов (Mandalari et al. , 2010). Бланшированная кожица миндаля, промышленно удаленная с ореха путем бланширования в горячей воде, составляет 4–8% от общей массы очищенного миндаля и считается побочными продуктами, которые, если их не обрабатывать, выбрасываются как отходы.

Материалы и методы

Шкурка миндаля

Натуральный миндаль (Maisie Jane’s, Калифорния) любезно предоставлен Миндальным советом Калифорнии и хранится в темноте.Кожу натурального миндаля (NS) удаляли обработкой жидким азотом, как описано ранее (Mandalari et al. , 2010). Шкуры размалывали с использованием аналитической мельницы (Janke & Kunkel A10). Бланшированные и сушеные кожуры миндаля (BS), произведенные ABCO Laboratories (порошок кожуры миндаля 1912 г.), были поставлены Миндальным советом Калифорнии.

Моделирование желудочно-кишечного переваривания NS и BS было выполнено с использованием протокола, описанного ранее (Mandalari et al., 2008а). Вкратце, для желудочного переваривания 1,5 г каждого продукта из кожи миндаля (NS, BS) суспендировали в 12,4 мл кислого солевого раствора (150 мМ NaCl, pH 2,5) и при необходимости доводили до pH 2,5 с помощью HCl. Затем добавляли суспензию везикул фосфатидилхолина, пепсин и аналог желудочной липазы так, чтобы конечные концентрации в водной фазе составляли 2,4 ммоль л ^-1 , 146 и 60 ед. Мл ^-1 , соответственно. Образцы помещали в инкубатор с орбитальным встряхиванием (170 об / мин, 37 ° C) на 2 часа.В качестве исходного материала для моделирования пищеварения двенадцатиперстной кишки использовали in vitro желудочного переваривания NS и BS. PH был увеличен до 6,5 добавлением NaOH и растворов солей желчных кислот, CaCl ₂ , бис-трис и ферментов в 150 ммоль л ^-1 NaCl добавили, так что конечные концентрации были следующими: 4 ммоль л ^-1 таурохолат натрия, 4 ммоль л ^-1 гликодеоксихолат натрия, 11,7 ммоль л ^-1 CaCl ₂ , 0,73 ммоль л ^-1 Bis-Tris буфер (pH 6.5), 5,9 ед. Мл ⁻¹ α-химотрипсина, 104 ед. Мл ⁻¹ трипсина, 3,2 мкг мл ⁻¹ колипазы, 54 ед. Мл ⁻¹ липазы поджелудочной железы и 25 ед. Мл ⁻¹ α -амилаза. Образцы помещали в инкубатор с орбитальным встряхиванием (170 об / мин, 37 ° C) на 1 час. Каждое расщепление in vitro с проводили не менее трех раз с твердым материалом, извлеченным для анализа.

Определение содержания липидов

Общий липид NS и BS после in vitro пищеварения желудка и желудка плюс двенадцатиперстная кишка определяли гравиметрически путем экстракции n -гексаном и выражали в% сухой массы (Mandalari et al., 2008а).

Анализ общего белка

Общее содержание белка в NS и BS и твердых остатках, извлеченных после in vitro переваривания желудка и двенадцатиперстной кишки, было проанализировано на общий азот по методу Кьельдаля, как сообщалось ранее (Mandalari et al. , 2008a). Значения были выражены как N × 6,25.

Определение пищевых волокон

Общие пищевые волокна (TDF), нерастворимые пищевые волокна (IDF) и растворимые пищевые волокна (SDF) были измерены в обезжиренных образцах NS, BS и post in vitro переваривания желудка и двенадцатиперстной кишки с использованием ферментно-гравиметрического метода AOAC, как описано ранее. (Mandalari et al., 2008а). Вкратце, трижды обезжиренные образцы NS и BS инкубировали при 100 ° C с термостабильной α-амилазой, затем при 60 ° C с протеазой и, наконец, с раствором амилоглюкозидазы. TDF, IDF и SDF были скорректированы на остаточный белок и золу. Опыты проводились в двух экземплярах.

Анализ клеточной стенки

Материал клеточной стенки получали из NS и BS после переваривания желудка и двенадцатиперстной кишки с использованием метода, описанного ранее (Mandalari et al., 2008а). Анализ сахара проводили путем кислотного гидролиза полисахаридов с последующим восстановлением, ацетилированием и количественным определением ацетатов альдита с помощью газожидкостной хроматографии с использованием методов, адаптированных из Blakeney et al. (1983). Общие уроновые кислоты определяли колориметрически при 580 нм по стандартной кривой галактуроновой кислоты с использованием метода Blumenkrantz & Asboe-Hansen (1973). Галактуроновую кислоту и глюкуроновую кислоту этим методом не различают.

Определение фенолов

Определение фенольных соединений и флавоноидов NS и BS, а также твердых остатков, извлеченных после переваривания in vitro желудка и двенадцатиперстной кишки, проводили с использованием системы ВЭЖХ Shimadzu, оснащенной детектором на матрице фотодиодов в УФ-видимом диапазоне и детектором флуоресценции (Hewlett Packard 1046A) .Детектирование проводили при 270 нм для гидроксибензойных кислот и флаванонов и при 370 нм для флавонолов. УФ-спектры различных соединений записывали от 240 до 400 нм. Длины волн, использованные для флуоресцентного детектирования флаван-3-олов, были: λ _из , 276 нм; λ _em , 316 нм. Сбор данных выполняли с использованием программного обеспечения для химической станции class-vp5 (Shimadzu, Япония), как сообщалось ранее (Mandalari et al. , 2010).

Периодическая ферментация фекалий

Сосуды для ферментера с водяной рубашкой (300 мл), заполненные 135 мл предварительно стерилизованной основной питательной среды (2 г л ^-1 пептонная вода, 2 г л ^-1 дрожжевой экстракт, 0.1 г л ^-1 NaCl, 0,04 г л ^-1 K ₂ HPO ₄ , 0,04 г л ^-1 KH ₂ PO ₄ , 0,01 г л ^-1 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 0,01 г л ^-1 CaCl ₂ · 6H ₂ O, 2 г л ^-1 NaHCO ₃ , 2 мл Твин 80, 0,02 г л ^-1 гемина, 10 мкл витамина К ₁ , 0,5 г л ^-1 цистеина HCl, 0,5 г л ^{-1 (} желчных солей, pH 7,0) инокулировали 15 мл фекальной суспензии, приготовленной путем гомогенизации 10% масс. v свежий фекальный материал одного здорового донора из 0.1 M фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), pH 7,0. Добавляли экстракт кожуры миндаля (NS или BS после переваривания) или фруктоолигосахариды (FOS) до конечной концентрации 1% (мас. / Об.). Отрицательный контроль проводили без добавления в сосуды ферментера. Каждый сосуд перемешивали с помощью магнитной мешалки, температуру устанавливали на 37 ° C и pH автоматически поддерживали на уровне 6,8. Анаэробные условия поддерживали путем барботирования сосудов бескислородным азотом при 15 мл мин. ^-1 . Образцы (5 мл) отбирали через 0, 4, 8 и 24 ч для подсчета бактерий и анализа жирных кислот.Ферментацию проводили в трех разных случаях.

Подсчет бактерий

Бактерии подсчитывали с помощью FISH (Rycroft et al. , 2001). Дублированные образцы ферментации разбавляли в четыре раза 4% (вес. / Об.) Фильтрованным параформальдегидом и фиксировали в течение ночи при 4 ° C. Затем образцы дважды промывали фильтрованным PBS (0,1 M, pH 7,0) и хранили при -20 ° C в PBS / этаноле (1: 1, об. / Об.) До дальнейшего анализа. Гибридизацию проводили при оптимальной температуре с использованием геноспецифичных олигонуклеотидных зондов, нацеленных на 16S рРНК, меченных флуоресцентным красителем Cy3 для различных бактериальных групп или 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндолом для общего числа клеток.Использованные зонды были Bif164, специфичными для Bifidobacterium (Langendijk et al. , 1995), Bac303, специфичными для Bacteroides (Manz et al. , 1996), Lab158, специфичными для Lactobacillus /00 Enterocppoccus. (Harmsen et al. , 1999), His150, специфичный для большинства видов группы Clostridium hystolyticum (кластеры Clostridium I и II) (Franks et al. , 1998) и EREC482, специфичный для большей части Clostridium coccoides — Группа Eubacterium rectale ( кластеры Clostridium XIVa и XIVb) (Corcoran et al., 2007).

Анализ короткоцепочечных жирных кислот (SCFA)

Образцы (1 мл) были удалены из ферментера периодической культуры и центрифугированы при 15 000 g в течение 5 мин; 20 мкл супернатанта вводили в систему ВЭЖХ, оборудованную детектором показателя преломления, как описано ранее (Mandalari et al. , 2008b). Количественное определение органических кислот проводили с использованием калибровочных кривых для уксусной, пропионовой, масляной и молочной кислот в концентрациях от 0.5 и 100 мМ, а результаты выражены в ммоль л ^-1 .

Статистический анализ

Различия между числом бактерий при 0, 8 и 24 часах ферментации для каждой партии культуры проверяли на достоверность парным тестом t , предполагая нормальное распределение, равные отклонения и учитывая обе стороны распределения. Различия считались значимыми, когда значение P было <0,05.

Результаты

Характеристика кожуры миндаля после моделирования пищеварения

В таблице 1 показан общий состав двух продуктов из кожуры миндаля (NS и BS) до и после желудочно-кишечного переваривания.Эти фракции впоследствии были использованы в качестве субстратов для модели толстой кишки. Концентрация сахара в кожуре миндаля существенно не изменилась после переваривания, галактуроновая кислота и глюкоза были основными присутствующими сахарами (36% и 29% от общего количества, соответственно), за которыми следовали арабиноза (18%) и ксилоза (8%). От 18% до 20% липидов и белков высвобождались из кожуры миндаля после переваривания in vitro желудка и двенадцатиперстной кишки, причем стадия желудочного переваривания отвечает за максимальную степень липолиза и протеолиза.На рисунке 1 показаны четыре основные группы полифенолов кожуры миндаля, присутствующие в NS и BS после in vitro пищеварения в желудке и двенадцатиперстной кишке. Более высокие выбросы флавоноидов и фенольных кислот во время пищеварения наблюдались с NS по сравнению с BS, причем NS были более биодоступными, чем BS, как после желудочного, так и после желудочного и двенадцатиперстного переваривания. Однако NS по-прежнему содержали более высокие количества полифенолов после переваривания: почти в 10 раз большее количество флаванолов и гидроксикоричной кислоты наблюдалось в NS по сравнению с BS, за исключением флаван-3-олов, присутствующих в более высоких количествах в BS.Основными идентифицированными полифенолами были катехин, эпикатехин, изорамнетин и кемпферол вместе с их производными сахаров.