В чем заключается процесс синтеза днк: В чем заключается процесс синтеза ДНК?

Содержание

В чем заключается процесс синтеза ДНК?

Репликация ДНК  — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15—20 различных белков, называемый реплисомой.
Репликация проходит в три этапа:
1.    инициация репликации
2.    элонгация
3.    терминация репликации.
Репликон — это участок ДНК, который содержит сайт инициации репликации и реплицируется после начала синтеза ДНК с этого сайта.
Суть репликации днк заключается в том, что специальный фермент разрывает слабые водородные связи, которые соединяют между собой нуклеотиды двух цепей.  
Основные ферменты репликации ДНК:
4.

    ДНК — полимераза
5.    ДНК-полимераза — фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов.
6.    ДНК — лигазы
7.    Лигаза — фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лиᴦᴎҏование). ДНК-лигазы — ферменты, катализирующие ковалентное сшивание цеᴨȇй ДНК при репликации.
8.    ДНК — хеликазы
9.    ДНК хеликазы — ферменты раскручивающие двуцепочечную спираль ДНК.
10.    ДНК-топоизомеразы
11.    ДНК-топоизомеразы-ферменты, изменяющие стеᴨȇньсверхспиральности и тип сверхспирали. Путём одноцепочечного разрыва они создают шарнир, вокруг которого нереплецированный дуплекс ДНК, находящейся ᴨȇред вилкой, может свободно вращаться. Это снимает механическое напряжение, возникающее при раскручивании двух цеᴨȇй в репликативной вилке, что является необходимым условием для её непрерывного движения.
12.    Праймаза
13.    Праймаза — фермент, обладающий РНК-полимеразной активностью; служит для образования РНК-праймеров, необходимых для инициации синтеза ДНК в точке ori и дальнейшем для синтеза отстающей цепи.

полуконсервативная репликация — это… Что такое полуконсервативная репликация?

полуконсервативная репликация
semiconservative replication — полуконсервативная репликация.Способ репликации двухцепочечной молекулы ДНК, при котором исходная молекула разделяется на две цепи (с образованием репликативной вилки replication fork>), каждая из которых служит матрицей для синтеза второй (новой) комплементарной полинуклеотидной цепи; гипотеза П.р. была выдвинута Дж.Уотсоном и Ф.Криком одновременно с идеей о двойной спирали ДНК, а доказана опытами М.Мезельсона и Ф.Сталя по переносу меченой ДНК с использованием метода центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия
cesium chloride equilibrium density gradient centrifugation
>.

(Источник: «Англо-русский толковый словарь генетических терминов». Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд-во ВНИРО, 1995 г.)

.

  • semiconservative replication
  • semiconserved base

Смотреть что такое «полуконсервативная репликация» в других словарях:

  • полуконсервативная репликация

    — Метод репликации молекулы ДНК, при которой каждая материнская цепь молекулы ДНК достраивает себе новую дочернюю цепь [http://www.dunwoodypress.com/148/PDF/Biotech Eng Rus.pdf] Тематики биотехнологии EN semiconservative replication …   Справочник технического переводчика

  • Полуконсервативная репликация — * паўкансерватыўная рэплікацыя * semiconservative replication тип репликации ДНК, при котором молекула делится продольно, каждая половина сохраняется и служит матрицей для образующейся новой нити. Термин был введен, когда точный процесс… …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • Репликация полуконсервативная — * рэплікацыя паўкансерватыўная * semi conservative replication процесс репликации, при котором дочерние клетки первого поколения получают одну цепь ДНК от родителей, а вторая цепь синтезируется вновь. Такой же процесс повторяется при образовании… …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • репликация θ-типа — репликация θ типа θ репликация Двунаправленная полуконсервативная репликация кольцевых молекул ДНК, начинающаяся с образования «вздутия», видимого под электронным микроскопом, расширяющегося в двух направлениях; перед… …   Справочник технического переводчика

  • θ-репликация — θ type replication репликация θ типа, θ репликация. Двунаправленная полуконсервативная репликация кольцевых молекул ДНК, начинающаяся с образования вздутия , видимого под электронным микроскопом, расширяющегося в двух направлениях; перед… …   Молекулярная биология и генетика.

    Толковый словарь.

  • Семиконсервативная репликация — * семікансерватыўная рэплікацыя * semiconservative replication …   Генетика. Энциклопедический словарь

  • генетический код —     Долгое время наследственные механизмы были предметом внимания генетиков, но природа молекул, переносящих информацию от одного индивида к другому, оставалась неведомой. Была известна роль макромолекул протеина и нуклеиновых кислот в этом… …   Западная философия от истоков до наших дней

  • История науки — История науки  это исследование феномена науки в его истории. Наука, в частности, представляет собой совокупность эмпирических, теоретических и практических знаний о Мире, полученных научным сообществом. Поскольку с одной стороны наука… …   Википедия

  • semiconservative replication — semiconservative replication. См. полуконсервативная репликация. (Источник: «Англо русский толковый словарь генетических терминов».

    Арефьев В.А., Лисовенко Л.А., Москва: Изд во ВНИРО, 1995 г.) …   Молекулярная биология и генетика. Толковый словарь.

  • 5 -гидроксиметилцитозин 5 -гМц — 5 гидроксиметилцитозин, 5 гМц * 5 гідроксіметылцытазін * 5 hydroxymethyl cytosine or 5 hMC пиримидиновое основание, замещающее цитозин в ДНК четных колифагов. 5 ГМЦ комплементарен гуанину. Считается, что фагоспецифичная ДНКаза бактериофага… …   Генетика. Энциклопедический словарь

Репликация | справочник Пестициды.ru

Репликация (вирусология) – это процесс самовоспроизведения нуклеиновых кислот, генов, хромосом. В его основе лежит ферментативный синтез ДНК или РНК, проходящий по матричному синтезу

[2].

Репликация нуклеиновых кислот является одним из основных этапов в системе синтеза компонентов в общей структуре репродукции вируса. Термином «репликация» в некоторых случаях обозначают весь процесс размножения вирусов, отождествляя его с термином «репродукция вируса»[1][2].

Механизм репликации, также, как и механизм транскрипции, зависит от типа геномной НК вирусов[1].

Механизм репликации ДНК-вирусов

При репликации двухнитчатых ДНК-вирусов матрицей для синтеза комплементарных дочерних цепей служит каждая из цепей родительской ДНК. Для репликации геномных ДНК большинство вирусов используют клеточные ферменты, в частности ДНК-зависимые ДНК-полимеразы. Некоторые крупные вирусы кодируют собственные репликазы

[3][1].

Вирусы, содержащие плюс-ДНК, начинают репликацию с синтеза комплиментарной минус-ДНК нити. Образуется двухспиральная репликативная форма, которая выступает в роли матрицы для синтеза новых плюс-цепей. Последние, вытесняются из репликативной формы и заключаются в белковую оболочку, превращаясь в вирионы[1].

Принципиальное отличие в репликации однонитевых ДНК содержащих вирусов от двухнитевых состоит в том, что в первом случае для формирования дочерних молекул используется только минус-цепь

[3][1].

Механизм репликации однонитевых РНК-вирусов

Репликация однонитевых РНК-вирусов в общих чертах сходна с репликацией однонитевых ДНК-вирусов. В начале процесса однонитевая родительская плюс-РНК служит матрицей для синтеза дочерней минус-РНК. В результате формируется двухспиральная репликативная форма[1].

Но за долго до окончания синтеза первой дочерней РНК, на репликативной форме инициируется синтез второй и последующих дочерних плюс-нитей. Этот процесс приводит к преобразованию репликативной формы в новую форму, именуемую репликативным предшественником[1].

Репликативный предшественник представляет собой двойную спираль РНК со свисающими «хвостами» плюс-РНК. Эти «хвосты» вытесняются из репликативного предшественника вновь синтезируемыми молекулами плюс-РНК

[3][1].

Механизм репликации двухцепочечных РНК-вирусов

РНК-вирусы с двухцепочечным геномом используют в качестве матриц для репликации только минус-нити. Эти вирусы отличает то, что уже на ранних стадиях инфекции в клетках-хозяевах накапливаются плюс-РНК. Некоторые из них становятся матрицами для репликации. Другие используются как иРНК[3][1].

Репликация ретровирусов

Репликация ретровирусов (семейство вирусов для которых характерен процесс обратной транскрипции) наблюдается на матрице провирусов (генома вируса, встроенного в ДНК клетки хозяина) после их индукции (процесса исключения провируса из состава хромосомы клетки-хозяина)[1].

Репликация провирусов происходит с помощью клеточных ферментов. В результате синтезируются многочисленные молекулы плюс-РНК и необходимые для сборки вирионов белки и ферменты[1].

 

Статья составлена с использованием следующих материалов:

Литературные источники:

1.

Домаранский И.В. Основы вирусологии для экологов. Под редакцией академика РАЕН В.А. Алешкина – Москва: ЛексЭст., 2007 – 80 с.

2.

Карташева И. А. Сельскохозяйственная фитовирусология, Учебное пособие. — М.: Колос; Ставрополь: АГРУС, 2007. — 168 с.

3.

Литусов Н.В. Физиология бактерий. Иллюстрированное учебное пособие. – Екатеринбург: Изд-во УГМУ, 2015. – 43 с

Свернуть Список всех источников

Новый способ синтеза ДНК позволит создавать гены за считанные часы

Из всех достижений в области генетических исследований процесс синтеза ДНК за последние четыре десятилетия не изменился. Это может стать серьёзным препятствием для учёных, которые разрабатывают новые препараты или исследуют человеческий организм. Тем не менее, всё может измениться с использованием современных технологий. Группа учёных из Института биоэнергетики в Беркли (США) разработала более быстрый, точный и доступный метод синтеза. Если всё пройдёт удачно, это значительно ускорит темпы медицинских и биохимических открытий.

Традиционный метод создания ДНК предполагает присоединение четырёх типов строительных блоков в определённой последовательности. Но такая цепь ограничена только 200 химическими основаниями (очень мизерное число как для генетики). Для создания небольшого гена может потребоваться несколько недель и примерно $300. Поэтому идеальный синтез является дорогостоящим процессом.

Новый подход заключается в использовании фермента, который содержится в клетках иммунной системы. Вместо копирования ДНК с помощью полимеразов, он добавляет четыре основные вида нуклеотидов к существующей ДНК. Таким образом можно добиться результата в 200 оснований за минуту и ДНК длиной до нескольких тысяч оснований. При этом число ошибок сводится к минимуму. Этот фермент называется терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (TdT).

Стоит признать такой метод синтеза ДНК пока ещё не готов к использованию. Его точность составляет 98%, в то время как традиционные методы показывают результат 99,5%. Если учёные улучшат свою технологию, это существенно изменит генетическое исследование. На синтез сложного гена потребуется всего несколько часов, что позволит создавать новые лекарства и биотопливо, а у исследователей останется больше времени на изучение того, что они создали.

Источник: lbl.gov

Страница не найдена |

Страница не найдена |

404. Страница не найдена

Архив за месяц

ПнВтСрЧтПтСбВс

45678910

11121314151617

18192021222324

252627282930 

       

       

       

     12

       

     12

       

      1

3031     

     12

       

15161718192021

       

25262728293031

       

    123

45678910

       

     12

17181920212223

31      

2728293031  

       

      1

       

   1234

567891011

       

     12

       

891011121314

       

11121314151617

       

28293031   

       

   1234

       

     12

       

  12345

6789101112

       

567891011

12131415161718

19202122232425

       

3456789

17181920212223

24252627282930

       

  12345

13141516171819

20212223242526

2728293031  

       

15161718192021

22232425262728

2930     

       

Архивы

Май

Июн

Июл

Авг

Сен

Окт

Ноя

Дек

Метки

Настройки
для слабовидящих

Репликация


Полимеразы эукариот

Основные результаты по репликации получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в зараженных клетках человека, культивируемых in vitro. В этой системе вирусный белок, называемый Т-антигеном, выполняет многие функции, необходимые для репликации вирусной ДНК. Во-первых, он является белком-инициатором, необходимым для инициации репликации; во-вторых, он обладает ДНК-геликазной активностью, т.е. расплетает цепи реплицируемой ДНК перед работающей ДНК-полимеразой, и, в-третьих, Т-антиген необходим для правильного взаимодействия с ДНК ферментного комплекса, синтезирующего праймеры (праймосомы). Тем не менее, вирус SV40 использует для репликации ДНК своей небольшой хромосомы и многие белки клетки-хозяина, что позволяет исследовать функционирование репликативного комплекса клеток человека в такой относительно простой системе.

У эукариот обнаружены шесть ДНК-полимераз, три из которых – α, δ и ε –непосредственно участвуют в репликации хромосомной ДНК. Аминокислотные последовательности этих трех ферментов гомологичны друг другу и последовательности продукта гена 43 бактериофага Т4.

Эукариотическая ДНК-праймаза в отличие от аналогичного белка прокариот образует постоянный комплекс с ДНК-полимеразой α, роль которого, по-видимому, ограничивается синтезом праймеров при репликации обеих цепей ДНК.

Белок PCNA и фактор репликации C (RFС) также образуют стабильный комплекс с ДНК-полимеразой δ, а в определенных условиях стимулируют и активность ДНК-полимеразы ε. Во многих отношениях PCNA и RFС являются функциональными аналогами соответственно β-белка и белков γ-комплекса E. coli, и их роль в синтезе ведущей и отстающей цепей ДНК вируса SV40 хорошо известна.

Механизмы репликации ДНК прокариот и эукариот существенно различаются в том отношении, что во втором случае синтез ведущей и отстающей цепей ДНК осуществляют разные ДНК-полимеразы (α и δ соответственно), тогда как у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III. ДНК-полимераза α проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала репликации, а ДНК-полимераза δ осуществляет циклические реинициации синтеза фрагментов Оказаки, по-видимому, распознавая наличие 5’-концевого нуклеотида очередного праймера с последующей диссоциацией от матричной ДНК и присоединением к ней для реинициации синтеза следующего фрагмента Оказаки. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-затравок с помощью 5’→3’-экзонуклеазы (белковые факторы FEN-1 или MF-1) и РНКазы h2, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под действием ДНК-лигазы I. Роль ДНК-полимеразы ε в настоящее время не ясна. Возможно, этот фермент непосредственно участвует в репликации или в сопряженной с репликацией репарации повреждений ДНК, а также в регуляции клеточного цикла. ДНК-полимераза ζ обнаружена в 1996 г. у дрожжей S. cerevisiae. При исследовании белков Rev3 и Rev7, которые необходимы для мутагенеза, индуцируемого в ответ на повреждения ДНК, оказалось, что их комплекс обладает ДНК-полимеразной активностью. Эта полимераза способна эффективно использовать в качестве матрицы ДНК, содержащую циклобутановые димеры. В таких условиях активность ДНК-полимеразы α составляет лишь 1% от активности ДНК-полимеразы ζ. ДНК-полимераза η, так же как и предыдущий фермент, участвует в SOS-ответе дрожжей на генотоксические воздействия. В присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов она осуществляет включение в строящуюся цепь ДНК напротив тиминовых димеров только правильных нуклеотидов (А).
Поскольку ДНК-полимеразы млекопитающих лишены 3′-5′- и 5′-3′-экзонуклеазных активностей, присущих ферментам Е. coli, остается неясно, как в процессе репликации ДНК у этих организмов удаляются случайно включенные ошибочные нуклеотиды и РНК-затравки фрагментов Оказаки.

Синтез лидирующей и отстающей цепи осуществляют разные дНК-полимеразы (альфа, дельта), тогда как у E. coli обе цепи ДНК синтезируются димером ДНК-полимеразы III.

ДНК-полимераза ? проводит инициацию синтеза ведущей цепи в точках начала репликации, а ДНК-полимераза ? осуществляет циклические реинициации синтеза фрагментов Оказаки, по-видимому, распознавая наличие 5’-концевого нуклеотида очередного праймера с последующей диссоциацией от матричной ДНК и присоединением к ней для реинициации синтеза следующего фрагмента
Оказаки. Созревание фрагментов Оказаки у эукариот требует удаления РНК-затравок с помощью 5’>3’-экзонуклеазы (белковые факторы FEN-1 или MF-1) и РНКазы h2, а также ковалентного соединения фрагментов друг с другом под действием ДНК-лигазы I.
ДНК-полимераза ? обнаружена в 1996 г. у дрожжей S. cerevisiae. При исследовании белков Rev3 и Rev7, которые необходимы для мутагенеза, индуцируемого в ответ на повреждения ДНК, оказалось, что их комплекс обладает ДНК-полимеразной активностью. Эта полимераза способна эффективно использовать в качестве матрицы ДНК, содержащую циклобутановые димеры. В таких условиях активность ДНК-полимеразы ? составляет лишь 1% от активности ДНК-полимеразы ?. ДНК-полимераза ?, так же как и предыдущий фермент, участвует в SOS-ответе дрожжей на генотоксические воздействия. В присутствии всех четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов она осуществляет включение в строящуюся цепь ДНК напротив тиминовых димеров только правильных нуклеотидов (А).

Точки начала репликации репликации

Ori — AT-богатые, легкоплавкие участки длинной ~200 пн, расположенные, как правило, между генами в промоторных областях.
Не все ori реплицируются в одном клеточном цикле.

Ориджины репликации могут располагаться внутри кодирующей части генов, напримр в гене (betta-глобине ципленка находится по крайней мере четыре ориджина репликации, причем было показано что активность генов не связана со степенью репликации. На выбор ориджинов репликации влияет ацетилирование гистонов, хотя данные противоречивы. Например, репликация в бетта-глобиновом локусе ципленка не чувствительна ни к ацетилированию ни к деацетилированию гистонов. В мышином HoxB локусе, ацетилирование гистонов имеет зависимость с молчанием ориджинов скорее чем их активация [Norio, 2006]

Инициация репликации

Инициация репликации у эукариот происходит на специфических множественных последовательностях нуклеотидов – репликаторах. Наиболее изученными являются репликаторы дрожжей S. cerevisiae, впервые идентифицированные как автономно реплицирующиеся последовательности (ARS – autonomously replicating sequence), способные поддерживать внехромосомную репликацию плазмид в дрожжевых клетках. Исследование структуры ARS1 показало, что этот хромосомный элемент состоит из нескольких коротких регуляторных последовательностей. Аналогичная организация характерна и для других ARS дрожжей. В частности, ARS307 в дополнение к канонической последовательности ACS, общей для всех ARS, содержат еще два элемента – B1 и B2, которые необходимы для выполнения репликатором своих функций in vivo. Несмотря на то что эти последовательности в разных репликаторах не строго консервативны, внутри групп (B1, B2 и т.п.) они функционально взаимозаменяемы. Изменение положения по отношению к ACS предотвращает их функционирование.

Первым этапом инициации репликации у дрожжей является взаимодействие регуляторных последовательностей репликатора, по крайней мере, с шестью различными белками, которые образуют комплекс, распознающий область начала репликации ORС (origin-recognition complex). ARS определяет место инициации репликации в клетках дрожжей. Элемент B3 ARS1 взаимодействует с белком Abf1, который стимулирует репликацию доменом, характерным для белков-активаторов транскрипции, тогда как B1 взаимодействует с ORC. Остающиеся регуляторные последовательности области начала репликации дрожжей образуют ранее неизвестный элемент,
названный ДНК-расплетающим элементом DUE (DNA-unwinding element), который, как полагают, облегчает раскручивание цепей ДНК при инициации репликации. Точковые мутации в элементе B2 не влияют на функции репликатора, что является общим свойством структурных элементов, тогда как мутации в ACS, B1 и B3 нарушают инициацию репликации, как и следовало ожидать от регуляторных элементов нуклеиновых кислот, взаимодействующих с белками.

Исследования репликаторов у дрожжей S. pombe показали, что область начала репликации ura4 включает в себя три отдельных репликатора, которые располагаются на участке ДНК длиной в 5 тпн. У млекопитающих области начала репликации располагаются на расстоянии ~100 тпн друг от друга. Синтез ДНК в отдельных репликонах происходит по двум направлениям, причем перемещение репликативной вилки осуществляется предпочтительно в одном направлении, которое может изменяться в зависимости от стадии развития организма и уровня экспрессии генов, содержащих репликаторы. Частота использования отдельных репликаторов
изменяется в онтогенезе, уменьшаясь в клетках взрослого организма. Сравнение первичных структур шести отдельных репликаторов эукариот показало, что все они содержат DUE-элементы, участки прикрепления к ядерному матриксу (SAR/MAR), канонические ARS-последовательности дрожжей, пиримидиновые тракты, а также ранее неидентифицированную каноническую последовательность WAWTTDDWWWDHWGWHMAWTT, где W = A/T, D = A/C/T, H = A/C/T, a M = A/C. Имеются отдельные сообщения о том, что в репликаторах животных присутствуют пуриновые тракты, канонические последовательности, взаимодействующие с факторами транскрипции и
белками репликативного комплекса, энхансерный октамерный мотив, сайты связывания продуктов онкогенов, AT-богатые последовательности и участки перегибов (bent) ДНК. В настоящее время до конца непонятно, какое непосредственное отношение имеют все эти регуляторные последовательности к инициации репликации ДНК. Предполагается, что многие из них участвуют в регуляции транскрипции (а следовательно, и регуляции экспрессии генов) как таковой, поскольку большинство из известных в
настоящее время репликаторов локализованы в 5’-концевых последовательностях функционирующих генов.

Элонгация репликации
Терминация репликации
Репликация теломерных районов хромосом

Синтез теломерных последовательностей ДНК осуществляется специальными ферментами – теломеразами. Особенностью этих ферментов является присутствие у них в качестве составной части короткого фрагмента РНК – компонента, служащего матрицей при синтезе теломерных последовательностей хромосом. Комплементарное взаимодействие внутренней РНК теломеразы с 3’-концевым выступающим одноцепочечным сегментом ДНК хромосомы инициирует синтез теломерных последовательностей. При этом 3’-концевой фрагмент ДНК служит затравкой для удлинения этой ДНК на РНК-матрице. После удлинения (элонгации) выступающей цепи ДНК до конца матрицы происходит транслокация фермента на один теломерный повтор вперед относительно матрицы с освобождением последовательности матричных нуклеотидов, после чего он готов для вступления в следующий цикл элонгации только что добавленной 3′-концевой последовательности хромосомы. После завершения удлинения одноцепочечной 3′-концевой теломерной последовательности вторая цепь ДНК достраивается обычным способом. Таким образом происходит решение «проблемы отстающей цепи ДНК» при репликации ДНК у эукариот. Наличие у животных тканеспецифичности в распределении теломер по размерам, а также изменение размеров этих последовательностей в онтогенезе предполагают существование механизмов, регулирующих данный процесс. Создается впечатление, что для активной пролиферации клеток теломерные последовательности не должны становиться короче определенного порогового размера. Недавние исследования обнаружили резкое повышение активности теломераз, характерное для опухолевых клеток, что служит в настоящее время чувствительным физиологическим маркером их злокачественного перерождения. В этой связи сегодня в качестве одного из подходов к терапии опухолей рассматривают подавление активности теломераз, функционирование которых, как полагают, необходимо для иммортализации клеток и роста опухолей. Именно благодаря таким свойствам теломеразы в последнее время вызывают особый интерес, что сопровождается расширением исследований в данной области молекулярной генетики.

Регуляция репликации
Пространственная организация репликации

В ядрах млекопитающих при репликации обнаруживается около 150 центров репликации — “репликативные фабрики” или реплисомы, которые приблизительно равномерно удалены друг от друга. Во время инициации синтеза ДНК размер этих центров мал, и они обнаруживаются в виде небольших четко очерченных «точек», которые со временем становятся более диффузными. В данных центрах репликации происходит аккумуляция белков, участвующих в синтезе ДНК: ДНК-полимеразы, PCNA и RP-A, а также регуляторных молекул типа циклина А, cdk2 и RPA70.
Иммунохимическими методами с использованием частиц коллоидного золота было показано, что растущие цепи ДНК выходят из центров репликации. Это позволяет предполагать, что во время репликативного синтеза цепи ДНК перемещаются через фиксированные внутри ядра структуры аппарата репликации. Такая внутриядерная компартментализация синтеза ДНК позволяет концентрировать регуляторные, структурные и ферментативные компоненты, участвующие в репликации и поддержании пространственной структуры хромосом. Ступенчатая сборка функционально активных элонгирующих комплексов в микрокомпартментах ядра предоставляет большие возможности для регуляции инициации репликативного синтеза ДНК.

Роль ядерных пространственных структур в обеспечении функциональных свойств ДНК можно рассмотреть на примере репликации
хромосом в ооцитах Xenopus laevis. Инъекция прокариотической ДНК в ооциты или ее добавление к экстрактам ооцитов сопровождается образованием псевдоядер, компетентных в отношении репликации ДНК. Репликация в таких системах пространственно упорядочена: она происходит в дискретных участках ДНК, содержащих кластеры репликативных вилок. При этом наблюдается замечательная корреляция между числом и пространственным распределением центров репликации в искусственных псевдоядрах и ядрах культивируемых клеток, находящихся в S-фазе. Следовательно, сборка функционирующих комплексов, способных инициировать репликацию, не находится в строгой зависимости от последовательностей нуклеотидов ДНК хромосом, но в большой степени зависит от внутренней пространственной структуры ядра и может эффективно происходить даже на прокариотических ДНК. Это означает, что пространственная структура ядра может непосредственно контролировать его функции, в данном случае – инициацию репликации хромосом. Следует, однако, иметь в виду, что на ранних эмбриональных стадиях развития Xenopus контроль репликации ослаблен, и число зон начала репликации значительно больше, чем в соматических клетках. Нормальный контроль репликации устанавливается после увеличения продолжительности клеточного цикла на стадии средней бластулы. В нормальных соматических клетках не все центры репликации одновременно начинают синтез ДНК. Некоторые из них функционируют в ранней, а некоторые в поздней S-фазе клеточного цикла. Такая дифференциальная репликация хромосом является важным регуляторным механизмом, обеспечивающим локальную организацию хроматина и активность генов. Аналогичное явление обнаружено в клетках дрожжей, где функционирование во времени центров репликации зависит от положения хромосом в ядре.

Эпигенетика: кто управляет нашей ДНК и как это можно использовать

— Какими грантами, патентами или стартапами может похвастаться ваш коллектив?

— В настоящий момент у нас есть несколько грантов по механизму транскрипции хроматина, есть по PARP и FACT. С окончания мегагранта нами получено три патента, и еще по одному есть положительное решение: мы разработали методику тестирования веществ, влияющих на процесс старения, а также противоопухолевых препаратов. Это все сделано на основе биохимических методов, сейчас же мы работаем с использованием FRET.

В целом же я придерживаюсь точки зрения профессора Преображенского: «Каждый занимается своим делом». Конечно, получаем патенты, сотрудничаем с коммерческими компаниями, но сильно в практику не уходим, распределяя силы между фундаментальными и прикладными исследованиями.

— Когда вы уехали в Америку?

— Я уехал в 1991, ровно за месяц до развала СССР. В итоге в один момент я оказался в Америке совсем без гражданства… Шучу! Конечно же, проблемы с документами решились быстро, но ситуация была интересная.

— Что заставило вас вернуться? Как много времени вы проводите в России теперь?

— Нельзя сказать «заставило»… Я всегда поддерживал контакт с Россией: были российские студенты и аспиранты, которые приезжали ко мне. Оставались тесные связи со своим родным вузом, Институтом молекулярной биологии и Институтом биологии гена. Мегагрант же показался мне интересной возможностью вернуть в Россию то, что я в свое время в некотором роде увез в США, тем более что при таком повороте политики правительства в отношении науки появился реальный шанс что-то создать. Я понимал, что это будет непросто, однако ввязался в сумасшедшую конкуренцию за мегагрант и выиграл его.

А вот второй вопрос в отношении меня немного неподходящий, поскольку в силу семейных обстоятельств в России я бываю гораздо реже, чем хотел бы. Стоить спросить вот что: сколько времени я уделяю лаборатории в МГУ? Ответ — очень много. Как минимум каждую неделю мы проводим трехчасовые семинары по скайпу, я общаюсь с сотрудниками по отдельности, да и вообще всячески участвую в жизни лаборатории. У нас сильно развито взаимодействие внутри коллектива, а это требует много времени и сил. Хотя, на самом деле, спустя столько лет работа вошла в режим автоматизма и некоторые решения (например, касающиеся оборудования) уже и не требуют моего вмешательства. Народ у нас в этом плане ответственный.

— После долгого отсутствия вы вернулись в свою альма-матер. Сильно ли изменился облик МГУ с момента вашего переезда в Америку?

— Я иногда приезжал в Москву. Могу сказать, что в середине-конце девяностых ситуация в МГУ была очень грустной. Порой создавалось впечатление динозавра, который вот-вот вымрет. А потом в начале нового тысячелетия произошел заметный подъем практически во всех областях науки, да и вообще МГУ похорошел, почистил перышки — теперь Университет в очень неплохой форме. Приятно это осознавать и даже в некоторой степени участвовать в его возрождении.

— Можете поделиться своими научными планами?

— Планы определяются людьми, которые работают в лаборатории. Будут развиваться два основных направления: структурная динамика хроматина в рамках эпигенетики и анализ различных процессов, участвующих в развитии рака. Это основные направления, однако мы не знаем, куда нас занесет через год или два смеется. И у сотрудников, и у меня постоянно возникают новые идеи — наука и лаборатория продолжают развиваться.

Автор — Анна Солдатенко

Понравился материал? Добавьте Indicator.Ru в «Мои источники» Яндекс.Новостей и читайте нас чаще.

Подписывайтесь на Indicator.Ru в соцсетях: Facebook, ВКонтакте, Twitter, Telegram, Одноклассники.

Синтез ДНК — обзор

Изменения ДНК головного мозга в процессе развития: влияние различных факторов

Синтез ДНК в головном мозге очень чувствителен к различным факторам. Воздействие этих факторов может повлиять на дальнейшие функции или состояния мозга в течение оставшейся части жизни животного. Этот важный вопрос подробно рассматривается в других местах этой книги. Однако мы считаем необходимым кратко остановиться на влиянии некоторых факторов на развитие мозга.

Кортизон и гидрокортизон (Howard, 1965; Winick & Coscia, 1968; Balazs & Cotterrell, 1972; Cotterrell и др. ., 1972; Ardeleanu & Sterescu, 1976) в высоких дозах приводят к заметному снижению массы мозга и содержания ДНК у крыс и мышей. Howard & Benjamins (1975) пришли к выводу, что дефицит ДНК после постнатального лечения кортизоном должен быть обусловлен, прежде всего, необратимым подавлением синтеза ДНК, главным образом с участием глии.

Weichsel (1974) обнаружил ускоренный синтез ДНК, которому предшествовала индукция тимидинкиназы, в мозжечке крыс, получавших тироксин в возрасте 1 дня, продолжающийся до 5-дневного возраста после рождения.Но к 12-дневному возрасту содержание мозжечковой ДНК значительно уменьшилось у животных, получавших тироксин, по сравнению с контрольной группой. Эти данные согласуются с данными Gourdon et al. (1973) и Patel и др. (1976). Более того, введение крысам пропилтиоурацила у плода и новорожденного вызывало замедление размножения клеток в головном мозге. Эта задержка исчезла к 35-дневному возрасту. Содержание ДНК в головном мозге одинаково как у обработанных, так и у контрольных животных (Gourdon et al ., 1973). Неонатальный гипотиреоз приводит к временной депрессии числа клеток в мозжечке (Patel et al. ., 1976). Компенсация общего числа клеток происходит за счет удлинения периода пролиферации, но клеточный состав коры мозжечка остается ненормальным. Петухи и др. (1969) предполагают, что избыток тироксина способствует быстрому появлению в молодом мозге паттернов метаболизма взрослых, а недостаток тироксина замедляет биохимическое созревание мозга.

Сообщалось, что введение гормона роста беременным крысам увеличивает количество клеток головного мозга у их потомства (Zamenhof et al. ., 1966).

Другие исследователи (Croskerry et al. ., 1973) не смогли воспроизвести влияние гормона роста на развитие головного мозга при наблюдении за поздним пренатальным и ранним постнатальным периодом в отношении общей ДНК головного мозга или общей массы головного мозга при рождении. Клеточный рост в гипофизарном мозге карликовых мышей исследовали Winick & Grant (1968) и Wintzerith et al. (1974). У взрослых гипофизарных карликовых мышей, у которых уменьшение массы печени и почек соответствовало массе тела (72% по сравнению с нормальными однопометниками), масса мозга изменялась меньше. Более того, общая ДНК мозга была лишь примерно на 10% ниже (незначительно) в мозге взрослых мутантов. Этот естественный пример дефицита гормона роста подчеркивает роль рецепторных участков для данного гормона и ткани (Wintzerith et al. ., 1974).

Недоедание беременных животных приводит к рождению потомства с меньшим весом мозга и измененным мозжечком.Однако, если этих потомков нормально кормить после рождения, они, по-видимому, развиваются так же, как и контрольные (Chase et al. ., 1971).

Миелинизация начинается у многих видов, таких как человек и морская свинка, еще до рождения, поэтому диета с ограниченным содержанием белка для беременных животных очень важна для развития центральной нервной системы. У молодых животных, включая детей, изменяется вес, рост и поведение, когда они становятся взрослыми, если их переводят на диету с ограниченным содержанием белка (Zamenhof et al ., 1972). Существует общее мнение о редукции ДНК головного мозга, особенно ДНК мозжечка (Winick & Noble, 1966; Howard & Granoff, 1967; Davrainville, 1970; Zamenhof et al. ., 1971; Winick, 1971; Tumbleson & Badger, 1974; Dobbing, 1976) в связи с тем, что мозжечок развивается позже, чем большой мозг. Уменьшение мозжечковой и церебральной ДНК в мозге крыс, подвергшихся недоеданию в неонатальном периоде путем выращивания в пометах слишком большого размера, указывает на уменьшение количества клеток в мозге, включая мозжечок.Было обнаружено, что мозжечковые уровни ДНК, но не церебральные уровни ДНК, коррелируют с двигательной активностью, контролируемой мозжечком. Таким образом, недоразвитие мозжечка может влиять на поведение (Rech & Weichsel, 1973).

Кратковременная гиперфенилаланинемия в раннем возрасте крыс оказывает постоянное влияние на репликацию клеток и рост мозжечка, но не головного мозга (Пренски и др. ., 1974). Дефицит цинка на протяжении последней трети беременности у крыс приводил к уменьшению размера мозга, не влияя на общую ДНК мозга; но дефицит цинка от рождения до 21-дневного возраста приводил к нарушению роста и уменьшению ДНК головного мозга (Sandstead et al . , 1975), что, вероятно, является действием на глиальные клетки.

Сообщалось о влиянии других факторов на синтез ДНК в процессе развития мозга. Гипероксия (Grave и др. ., 1970) у новорожденных детенышей вызывала уменьшение ДНК в сером веществе.

Онтогенез сетчатки и зрительной коры кролика модулируется светом. При отключении света сразу после рождения нарушалась эволюция нуклеиновых кислот. Обычная редукция нуклеиновых кислот при развитии сетчатки не происходит, как в нормальной сетчатке (Mandel & Goswamy, 1966).

Ежедневное рентгеновское облучение (100 Р) у крыс от рождения до 10-го дня незначительно влияло на рост головного мозга, но сильно замедляло мозжечок, прежде всего из-за угнетения образования новых клеток. Однако формирование клеток не было необратимо нарушено, но восстановление не было полным. В 23-дневном возрасте снижение общего числа клеток составило 40% по сравнению с контрольными животными (Пател и др. ., 1975).

Лекарственные препараты, такие как хлорпромазин, не влияют на содержание ДНК ни в коре головного мозга, ни в мозжечке, но предотвращают индуцированный электрошоком рост ДНК в мозжечке в раннем постнатальном развитии (Vernadakis, 1972).

Метилазо-оксиметанол, нейротоксический препарат, при введении крысам на 1, 2, 3 день постнатального развития приводит к снижению на 50% ДНК мозжечка на 7 день. За этим следует регенеративная фаза восстановления поврежденного мозжечка, которая прекращается примерно на 17-й день после рождения (Chanda et al. ., 1973).

О влиянии различных условий окружающей среды на биохимические и анатомические корреляты сообщили Rosenzweig & Bennett (1969), Bennett & Rosenzweig (1971); Животные в «обогащенном состоянии» имели большую массу и толщину коры головного мозга, чем однопометники в бедной среде.Эти результаты предполагают изменение синтеза ДНК, то есть пролиферации клеток в различных условиях. Церебральное содержание ДНК и РНК было значительно ниже в мозге развивающихся новорожденных, сосущих грудь от матерей, получавших этанол, по сравнению с соответствующими контрольными животными (Rawat, 1975).

Определение и методы синтеза ДНК

Определение синтеза ДНК

Синтез ДНК определяется как процесс, посредством которого копии нуклеиновых кислот соединяются вместе для формирования более длинной последовательности ДНК в лабораторных условиях.

Процессы синтеза ДНК

Олигомеры ДНК являются основой процесса синтеза ДНК. Существенной особенностью синтеза ДНК является то, что не используется выделенная естественным путем ДНК. Этот шаг отличается от традиционного метода изучения генетики, с помощью которого из организма извлекается ранее существовавшая генетическая последовательность для ее амплификации и последующего изучения. Благодаря синтезу гена мы в Synbio Technologies способны генерировать генетические последовательности de novo, которых в настоящее время может не быть нигде в природе.Хотя промежуточные продукты на основе клональных плазмид могут существовать во время сборки ДНК-мишени, каждое основание возникает как молекула фосфорамидита в начале синтеза ДНК. Сегодня все методы синтеза ДНК начинаются с твердофазной химии фосфорамидитов для построения одноцепочечных молекул ДНК размером от 10 до 100 пар оснований в длину. Эти одноцепочечные молекулы затем ферментативно собираются в более крупные молекулы. Затем этот процесс повторяется до тех пор, пока не будет сгенерирована требуемая длина последовательности.Этот процесс был усовершенствован компанией Synbio Technologies с помощью нашей трехэтапной платформы Syno. Эта платформа предлагает возможность генерировать последовательности длиной до 150 КБ включительно со стопроцентной точностью, гарантируя идентичность последовательности, запрошенной заказчиком.

Сборка ДНК для синтеза в дрожжах

Обычно используемый метод сборки фрагмента ДНК заключается в использовании промежуточного продукта дрожжей. Дрожжи, более известные как Saccharomyces cerevisiae, могут синтезировать одноцепочечную ДНК с минимальной длиной 38 перекрывающихся пар оснований и линейный двухцепочечный вектор за одно событие трансформации.Таким образом, олигонуклеотиды могут синтезировать ДНК в широком диапазоне длин, от всего лишь 20 пар оснований до 200 пар оснований. Сборка синтеза ДНК у дрожжей является полезным методом создания синтетических молекул ДНК относительно большой длины. Поскольку дрожжи обладают мощной способностью синтезировать и рекомбинировать фрагменты ДНК, дрожжи стали моделью эукариот для изучения многочисленных клеточных процессов. В дополнение к этому преимуществу гомологичную рекомбинацию у дрожжей можно использовать для построения фрагментов ДНК из перекрывающихся составных частей.

Метод одностадийного синтеза ДНК TopDown

Синтез ДНК TopDown представляет собой простой и экономичный метод сборки длинных генетических последовательностей длиной до 150 кб включительно. Метод синтеза ДНК TopDown можно отличить от обычных методов синтеза генов двумя ключевыми особенностями. Во-первых, температура плавления внешних праймеров рассчитана примерно на 8°C ниже, чем у сборочных олигонуклеотидов. Во-вторых, существуют различные температуры отжига, которые используются для выборочного контроля эффективности сборки олигонуклеотидов и полноразмерной матричной амплификации.Метод синтеза ДНК TopDown является эффективным способом устранения помех между сборкой ПЦР и амплификации. Это вмешательство между сборкой ПЦР и амплификации было связано с развитием определенных сбоев в процессе синтеза ДНК. Это демонстрирует, что синтез ДНК TopDown является методом, который может оптимизировать синтез ДНК при определенных условиях.

Synbio Technologies — компания, занимающаяся технологиями ДНК, основным направлением деятельности которой является синтез ДНК. Это видно в наших высококачественных продуктах, созданных на собственной платформе Syno ® для синтеза ДНК Synbio Technologies, которая может синтезировать последовательности длиной до 150 кб включительно.Эта длина характерна для последовательностей ДНК, из которых состоят гены, геномы и различные биологические пути. В дополнение к этому, профессиональное программное обеспечение Syno ® Codon может значительно оптимизировать исходные последовательности от клиентов и предоставить синтезированные последовательности ДНК со стопроцентной точностью в течение 5 дней. Именно эти факторы позволили Synbio Technologies стать одной из ведущих компаний в отрасли генного синтеза.

Услуги, связанные с синтезом ДНК

Механизм синтеза ДНК

Копирование рецепта жизни

ДНК, или дезоксирибонуклеиновая кислота, представляет собой биологическую молекулу, которая содержит информацию, необходимую для создания живого организма.Поскольку клетка делится, чтобы стать двумя, ДНК должна быть скопирована, чтобы обе клетки содержали необходимую генетическую информацию. Синтез или создание новых цепей ДНК в живых клетках называется «репликацией ДНК».

Репликация ДНК. Кредит изображения: Designua / Shutterstock

Создание новой нити ДНК

ДНК представляет собой двойную спираль, где две нити ДНК связаны вместе в две спирали. Процесс репликации ДНК начинается, когда две нити ДНК расходятся.Фермент, называемый геликазой, раскручивает и разделяет связи между двумя цепями ДНК, и обе эти разделенные нити действуют как шаблоны, из которых создается новая ДНК.

Репликация ДНК — 3D Игра

ДНК-полимеразы представляют собой группу ферментов, которые создают новую ДНК. Но для того, чтобы этот фермент работал, ему нужен праймер — короткая последовательность нуклеотидов, прикрепленная к одной из отдельных цепей ДНК. Во время репликации ДНК праймер обычно представляет собой короткую последовательность рибонуклеиновой кислоты (РНК), которая позже расщепляется и заменяется ДНК.

Праймер обеспечивает 3′-гидроксильную группу, к которой ДНК-полимераза добавляет предшественники ДНК, нуклеотиды. Когда нуклеотиды добавляются к 3′-концу праймера или новой цепи ДНК, образуется связь между 3′-гидроксильной группой праймера/новой ДНК и 5′-фосфатной группой нуклеотида.

Существует четыре типа нуклеотидов ДНК, каждый из которых имеет разное азотистое основание; аденин (А), цитозин (С), гуанин (Г) и тимин (Т). Они всегда встречаются парами: A-T и C-G.Это называется «спариванием оснований Уотсона-Крика», и, таким образом, если матрица содержит нуклеотид «А», то к растущей цепи ДНК будет добавлен нуклеотид «Т». Если это нуклеотид «G», то к растущей цепи будет добавлен нуклеотид «C».

Направленность ДНК и ее влияние на синтез ДНК

ДНК

имеет направленность: одна нить идет от 5’ к 3’, а другая идет от 3’ к 5’. В 5′-3′-цепи 3′-конец обнажается во время синтеза новой ДНК.Это означает, что ДНК-полимераза способна создавать новую ДНК в направлении ДНК-матрицы.

Однако, когда речь идет о подставке 3–5 футов, 5-футовый конец остается открытым; как с этим справится ДНК-полимераза? В цепи 3’–5’ новая ДНК создается ДНК-полимеразой, образующей короткие 5’–3’-фрагменты, называемые фрагментами Окадзаки. Затем другой фермент, ДНК-лигаза, соединяет фрагменты Окадзаки вместе, образуя новую цепь ДНК 3’-5’.

Корректура

Иногда допускаются ошибки при добавлении нуклеотидов в цепь матричной ДНК.Некоторые ДНК-полимеразы обладают так называемой «3’-5’-экзонуклеазной активностью». Экзонуклеазная активность 3’-5’, работающая против полимеразной или синтетической активности, отсекает нуклеотиды, которые не соответствуют матрице. Это обеспечивает корректуру, чтобы новая цепь ДНК была максимально точной.

Как это используется в молекулярной биологии?

Свойства синтеза ДНК использовались в различных методах молекулярной биологии; полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенирование ДНК.

Полимеразная цепная реакция

ПЦР — это метод, разработанный в 1980-х годах для амплификации определенной части ДНК. ДНК-праймеры предназначены для покрытия интересующей области. Для разделения двух цепей ДНК используется тепло, а затем температура понижается, чтобы праймеры могли прикрепиться к ДНК. Затем термостабильная ДНК-полимераза создает новые цепи ДНК, соответствующие интересующей области, добавляя нуклеотиды к 3′-концу праймеров.

Полимеразная цепная реакция Play

Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК

определяет порядок оснований (A, C, G, T), обнаруженных в ДНК.Секвенирование по Сэнгеру — один из первых методов секвенирования ДНК, при котором синтез ДНК останавливается. Это стало возможным благодаря удалению гидроксильной группы с 3′-конца нуклеотидов, поэтому, когда эти «дидезоксинуклеотиды» включаются в цепь ДНК, ДНК-полимераза не может добавить следующий нуклеотид. Эти дидезоксинуклеотиды смешиваются с нуклеотидами, поэтому создаются фрагменты различной длины. Имея дидезокси-A, дидезокси-C, дидезокси-G и дидезокси-T в отдельных реакциях, можно определить последний нуклеотид фрагмента.После разделения по размеру последовательность ДНК можно определить, посмотрев, какие последние нуклеотиды фрагментов соответствуют размеру.

Хотя современные методы секвенирования ДНК автоматизированы и менее трудоемки, чем секвенирование по Сэнгеру, некоторые из них основаны на секвенировании по Сэнгеру; например, к каждому дидезоксинуклеотиду могут быть добавлены разные флуоресцентные красители, и различия обнаруживаются по разным цветам флуоресценции.

Дополнительное чтение

Репликация ДНК – Концепции биологии

Цели обучения

К концу этого раздела вы сможете:

  • Объясните процесс репликации ДНК
  • Объясните важность теломеразы для репликации ДНК
  • Описать механизмы репарации ДНК

Когда клетка делится, важно, чтобы каждая дочерняя клетка получила идентичную копию ДНК. Это достигается за счет процесса репликации ДНК. Репликация ДНК происходит во время фазы синтеза или S-фазы клеточного цикла, прежде чем клетка вступает в митоз или мейоз.

Выяснение структуры двойной спирали дало представление о том, как копируется ДНК. Напомним, что адениновые нуклеотиды сочетаются с тиминовыми нуклеотидами, а цитозин с гуанином. Это означает, что две нити дополняют друг друга. Например, цепь ДНК с нуклеотидной последовательностью AGTCATGA будет иметь комплементарную цепь с последовательностью TCAGTACT ([Рисунок 1]).

Рисунок 1: две цепи ДНК комплементарны, что означает, что последовательность оснований в одной цепи может быть использована для создания правильной последовательности оснований в другой цепи.

Из-за комплементарности двух цепочек наличие одной нити означает возможность воссоздания другой нити. Эта модель репликации предполагает, что две нити двойной спирали расходятся во время репликации, и каждая нить служит матрицей, с которой копируется новая комплементарная нить ([Рисунок 2]).

Рисунок 2: Показана полуконсервативная модель репликации ДНК. Серым цветом обозначены исходные цепи ДНК, а синим — вновь синтезированная ДНК.

Во время репликации ДНК каждая из двух цепей, составляющих двойную спираль, служит шаблоном, с которого копируются новые цепи. Новая цепь будет комплементарна родительской или «старой» цепи. Каждая новая двойная цепь состоит из одной родительской цепи и одной новой дочерней цепи. Это известно как полуконсервативная репликация. При образовании двух копий ДНК они имеют одинаковую последовательность нуклеотидных оснований и поровну делятся на две дочерние клетки.

Поскольку эукариотические геномы очень сложны, репликация ДНК представляет собой очень сложный процесс, в котором участвуют несколько ферментов и других белков. Он протекает в три основных этапа: инициация, элонгация и терминация.

Напомним, что эукариотическая ДНК связана с белками, известными как гистоны, и образует структуры, называемые нуклеосомами. Во время инициации ДНК становится доступной для белков и ферментов, участвующих в процессе репликации. Как механизм репликации узнает, где начинается двойная спираль ДНК? Оказывается, существуют определенные последовательности нуклеотидов, называемые точками начала репликации, с которых начинается репликация.Определенные белки связываются с точкой начала репликации, в то время как фермент, называемый геликазой, раскручивает спираль ДНК. Когда ДНК раскрывается, образуются Y-образные структуры, называемые репликационными вилками ([Рисунок 3]). В начале репликации формируются две вилки репликации, которые расширяются в обоих направлениях по мере репликации. На эукариотической хромосоме существует несколько источников репликации, так что репликация может происходить одновременно из нескольких мест в геноме.

Во время элонгации фермент, называемый ДНК-полимеразой, добавляет нуклеотиды ДНК к 3′-концу матрицы.Поскольку ДНК-полимераза может добавлять новые нуклеотиды только в конце остова, последовательность праймеров, которая обеспечивает эту отправную точку, добавляется с комплементарными нуклеотидами РНК. Позже этот праймер удаляют, а нуклеотиды заменяют нуклеотидами ДНК. Одна цепь, комплементарная родительской цепи ДНК, непрерывно синтезируется в направлении репликационной вилки, поэтому полимераза может добавлять нуклеотиды в этом направлении. Эта непрерывно синтезируемая цепь известна как ведущая цепь.Поскольку ДНК-полимераза может синтезировать ДНК только в направлении от 5′ к 3′, другая новая цепь собирается в короткие фрагменты, называемые фрагментами Окадзаки. Каждому из фрагментов Окадзаки для начала синтеза требуется праймер, состоящий из РНК. Цепь с фрагментами Окадзаки известна как отстающая нить. В ходе синтеза фермент удаляет РНК-праймер, который затем заменяется нуклеотидами ДНК, а промежутки между фрагментами заделываются ферментом, называемым ДНК-лигазой.

Процесс репликации ДНК можно обобщить следующим образом:

  1. ДНК раскручивается в точке начала репликации.
  2. К комплементарным родительским цепям добавляются новые основания. Одна новая прядь изготавливается непрерывно, а другая прядь изготавливается по частям.
  3. Удаляют праймеры, вместо праймеров помещают новые нуклеотиды ДНК и остов запечатывают с помощью ДНК-лигазы.

Художественная связь

Рисунок 3: Репликационная вилка образуется за счет открытия точки начала репликации, и геликаза разделяет нити ДНК. Синтезируется РНК-праймер, который удлиняется ДНК-полимеразой.На ведущей цепи ДНК синтезируется непрерывно, тогда как на отстающей цепи ДНК синтезируется короткими отрезками. Фрагменты ДНК соединяют с помощью ДНК-лигазы (не показано).

Вы изолируете клеточный штамм, в котором соединение фрагментов Оказаки нарушено, и подозреваете, что произошла мутация в ферменте, обнаруженном на репликационной вилке. Мутация какого фермента наиболее вероятна?

[reveal-answer q=”208509″]Показать ответ[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”208509″]лигаза, так как этот фермент соединяет фрагменты Окадзаки.[/скрытый ответ]

 

Репликация теломер

Поскольку эукариотические хромосомы линейны, репликация ДНК происходит в конце линии в эукариотических хромосомах. Как вы уже знаете, фермент ДНК-полимераза может присоединять нуклеотиды только в одном направлении. В ведущей цепи синтез продолжается до тех пор, пока не будет достигнут конец хромосомы; однако на отстающей цепи нет места для создания праймера для копируемого фрагмента ДНК на конце хромосомы.Это представляет проблему для клетки, потому что концы остаются непарными, и со временем эти концы становятся все короче, поскольку клетки продолжают делиться. Концы линейных хромосом известны как теломеры, которые имеют повторяющиеся последовательности, не кодирующие определенный ген. Как следствие, с каждым раундом репликации ДНК укорачиваются не гены, а теломеры. Например, у человека последовательность из шести пар оснований, TTAGGG, повторяется от 100 до 1000 раз. Открытие фермента теломеразы ([Рисунок 4]) помогло понять, как поддерживаются концы хромосом.Теломераза прикрепляется к концу хромосомы, а на конце цепи ДНК добавляются основания, комплементарные матрице РНК. Как только матрица отстающей нити становится достаточно удлиненной, ДНК-полимераза теперь может добавлять нуклеотиды, комплементарные концам хромосом. Таким образом, концы хромосом реплицируются.

Рисунок 4: Концы линейных хромосом поддерживаются действием фермента теломеразы.

Теломераза обычно активна в зародышевых клетках, взрослых стволовых клетках и некоторых раковых клетках.За открытие теломеразы и ее действия Элизабет Блэкберн ([Рисунок 5]) получила Нобелевскую премию по медицине и физиологии в 2009 году.

Рисунок 5: Элизабет Блэкберн, лауреат Нобелевской премии 2009 года, была ученым, открывшим, как работает теломераза. (кредит: посольство США, Стокгольм, Швеция)

Теломераза не активна во взрослых соматических клетках. Взрослые соматические клетки, которые подвергаются клеточному делению, по-прежнему имеют укороченные теломеры. По сути, это означает, что укорочение теломер связано со старением.В 2010 году ученые обнаружили, что теломераза может обратить вспять некоторые возрастные состояния у мышей, и это может иметь потенциал в регенеративной медицине. 1 В этих исследованиях использовались мыши с дефицитом теломеразы; у этих мышей наблюдается атрофия тканей, истощение стволовых клеток, недостаточность системы органов и нарушение реакции на повреждение тканей. Реактивация теломеразы у этих мышей вызвала удлинение теломер, уменьшение повреждения ДНК, обратимую нейродегенерацию и улучшение функционирования яичек, селезенки и кишечника.Таким образом, реактивация теломер может иметь потенциал для лечения возрастных заболеваний у людей.

Репликация ДНК у прокариот

Напомним, что прокариотическая хромосома представляет собой кольцевую молекулу с менее обширной спиральной структурой, чем у эукариотических хромосом. Эукариотическая хромосома линейна и сильно закручена вокруг белков. Хотя в процессе репликации ДНК есть много общего, эти структурные различия обусловливают некоторые различия в процессе репликации ДНК у этих двух форм жизни.

Репликация ДНК

чрезвычайно хорошо изучена у прокариот, в первую очередь из-за небольшого размера генома и большого количества доступных вариантов. Escherichia coli имеет 4,6 миллиона пар оснований в одной кольцевой хромосоме, и все они реплицируются примерно за 42 минуты, начиная с одного источника репликации и проходя по хромосоме в обоих направлениях. Это означает, что в секунду добавляется примерно 1000 нуклеотидов. Процесс идет намного быстрее, чем у эукариот.[ссылка] суммирует различия между прокариотическими и эукариотическими репликациями.

Различия между репликациями прокариот и эукариот
Собственность Прокариоты Эукариоты
Происхождение репликации Одноместный Несколько
Скорость репликации 1000 нуклеотидов/с от 50 до 100 нуклеотидов/с
Хромосомная структура круговой линейный
Теломераза Нет Подарок

 

Просмотрите учебник по репликации ДНК.

 

ДНК-полимераза может ошибаться при добавлении нуклеотидов. Он редактирует ДНК, проверяя каждую вновь добавленную базу. Неправильные основания удаляются и заменяются правильным основанием, а затем полимеризация продолжается ([Рисунок 6] и ). Большинство ошибок исправляются во время репликации, хотя, когда этого не происходит, используется механизм исправления несоответствия. Ферменты репарации несоответствия распознают неправильно включенное основание и удаляют его из ДНК, заменяя правильным основанием ([Рис. 6] b ).При еще одном типе репарации, эксцизионной репарации нуклеотидов, двойная цепь ДНК раскручивается и разделяется, удаляются неправильные основания вместе с несколькими основаниями на 5′- и 3′-концах, которые заменяются путем копирования матрицы с помощью ДНК-полимеразы ([Фигура 6] c ). Эксцизионная репарация нуклеотидов особенно важна для коррекции димеров тимина, которые в первую очередь вызываются ультрафиолетовым светом. В димере тимина два нуклеотида тимина, соседствующие друг с другом на одной цепи, ковалентно связаны друг с другом, а не с комплементарными основаниями. Если димер не удалить и не восстановить, это приведет к мутации. Люди с дефектами в генах эксцизионной репарации нуклеотидов проявляют чрезвычайную чувствительность к солнечному свету и рано заболевают раком кожи.

Рисунок 6: Корректура с помощью ДНК-полимеразы (а) исправляет ошибки во время репликации. При восстановлении несоответствия (б) неправильно добавленная база обнаруживается после репликации. Белки восстановления несоответствия обнаруживают это основание и удаляют его из вновь синтезированной цепи под действием нуклеазы. Промежуток теперь заполнен правильно спаренной базой.Удаление нуклеотидов (с) восстанавливает димеры тимина. При воздействии УФ-излучения тимины, лежащие рядом друг с другом, могут образовывать димеры тимина. В нормальных клетках они вырезаются и замещаются.

Исправлено большинство ошибок; в противном случае они могут привести к мутации, определяемой как постоянное изменение в последовательности ДНК. Мутации в генах репарации могут привести к серьезным последствиям, таким как рак.

ДНК

реплицируется полуконсервативным методом, в котором каждая из двух цепочек родительской ДНК действует как матрица для синтеза новой ДНК.После репликации каждая ДНК имеет одну родительскую или «старую» цепь и одну дочернюю или «новую» цепь.

Репликация у эукариот начинается с нескольких источников репликации, в то время как репликация у прокариот начинается с одного источника репликации. ДНК вскрывается ферментами, в результате чего образуется репликационная вилка. Primase синтезирует РНК-праймер для инициации синтеза ДНК-полимеразой, которая может добавлять нуклеотиды только в одном направлении. Одна цепь синтезируется непрерывно в направлении репликационной вилки; это называется ведущей нитью.Другая цепь синтезируется в направлении, противоположном репликационной вилке, на коротких участках ДНК, известных как фрагменты Оказаки. Эта нить известна как отстающая нить. После завершения репликации РНК-праймеры заменяются нуклеотидами ДНК, а ДНК запечатывается с помощью ДНК-лигазы.

Концы хромосом эукариот представляют собой проблему, так как полимераза не может удлинить их без праймера. Теломераза, фермент со встроенной матрицей РНК, удлиняет концы, копируя матрицу РНК и удлиняя один конец хромосомы.Затем ДНК-полимераза может удлинить ДНК с помощью праймера. Таким образом, концы хромосом защищены. В клетках есть механизмы для восстановления ДНК, когда она повреждается или при репликации возникают ошибки. Эти механизмы включают репарацию несоответствия для замены нуклеотидов, которые связаны с некомплементарным основанием, и эксцизионную репарацию нуклеотидов, которая удаляет поврежденные основания, такие как димеры тимина.

ДНК реплицируется с помощью какой из следующих моделей?

  1. консервативный
  2. полуконсервативный
  3. дисперсионный
  4. ничего из вышеперечисленного

[reveal-answer q=»125616″]Показать ответ[/reveal-answer]
[hidden-answer a=»125616″]2[/hidden-answer]

Первоначальным механизмом исправления нуклеотидных ошибок в ДНК является ________.

  1. ремонт несоответствия
  2. Вычитка ДНК-полимеразой
  3. эксцизионная репарация нуклеотидов
  4. димеры тимина

[reveal-answer q=»128856″]Показать ответ[/reveal-answer]
[hidden-answer a=»128856″]2[/hidden-answer]

Каким образом линейные хромосомы эукариот обеспечивают полную репликацию своих концов?

Теломераза имеет встроенную РНК-матрицу, которая удлиняет 3′-конец, поэтому синтезируется и удлиняется праймер.Таким образом, концы защищены.

Сноски

  1. Mariella Jaskelioff, et al., «Реактивация теломеразы обращает вспять дегенерацию тканей у старых мышей с дефицитом теломеразы», ​​ Nature , 469 (2011):102–7.

Глоссарий

ДНК-лигаза
фермент, катализирующий соединение фрагментов ДНК вместе
ДНК-полимераза
фермент, синтезирующий новую цепь ДНК, комплементарную матричной цепи
спираль
фермент, который помогает открывать спираль ДНК во время репликации ДНК, разрывая водородные связи
отстающая прядь
во время репликации 3′-5′-цепи, цепи, которая реплицируется короткими фрагментами и удалена от репликационной вилки
ведущая ветвь
цепь, которая непрерывно синтезируется в направлении от 5′ к 3′, которая синтезируется в направлении репликационной вилки
ремонт несоответствия
форма репарации ДНК, при которой некомплементарные нуклеотиды распознаются, вырезаются и заменяются правильными нуклеотидами
мутация
постоянное изменение в последовательности нуклеотидов генома
эксцизионная репарация нуклеотидов
форма репарации ДНК, при которой молекула ДНК раскручивается и разделяется в области повреждения нуклеотида, поврежденные нуклеотиды удаляются и заменяются новыми нуклеотидами с использованием комплементарной цепи, а цепь ДНК повторно запечатывается и позволяет воссоединиться с комплементарной ей цепью.
Фрагменты Окадзаки
фрагменты ДНК, которые синтезируются короткими участками на отстающей цепи
грунтовка
короткий участок нуклеотидов РНК, необходимый для инициации репликации и обеспечения возможности связывания ДНК-полимеразы и начала репликации
вилка репликации
Y-образная структура, образующаяся при инициации репликации
полуконсервативная репликация
метод, используемый для репликации ДНК, при котором двухцепочечная молекула отделяется, и каждая цепь действует как матрица для синтеза новой цепи, поэтому полученные молекулы ДНК состоят из одной новой цепи нуклеотидов и одной старой цепи нуклеотидов.
теломераза
фермент, содержащий каталитическую часть и встроенную РНК-матрицу; он поддерживает теломеры на концах хромосом
теломер
ДНК на концах линейных хромосом

 

9.

2 Репликация ДНК — Концепции биологии — 1-е канадское издание

Цели обучения

К концу этого раздела вы сможете:

  • Объясните процесс репликации ДНК
  • Объясните важность теломеразы для репликации ДНК
  • Описать механизмы репарации ДНК

Когда клетка делится, важно, чтобы каждая дочерняя клетка получила идентичную копию ДНК . Это достигается за счет процесса репликации ДНК.Репликация ДНК происходит во время фазы синтеза или S-фазы клеточного цикла, прежде чем клетка вступает в митоз или мейоз.

Выяснение структуры двойной спирали дало представление о том, как копируется ДНК. Напомним, что адениновые нуклеотиды сочетаются с тиминовыми нуклеотидами, а цитозин с гуанином. Это означает, что две нити дополняют друг друга. Например, цепь ДНК с последовательностью нуклеотидов AGTCATGA будет иметь комплементарную цепь с последовательностью TCAGTACT (рис. 9.8).

Рисунок 9.8. Две цепи ДНК комплементарны, а это означает, что последовательность оснований в одной цепи может быть использована для создания правильной последовательности оснований в другой цепи.

Из-за комплементарности двух нитей наличие одной нити означает возможность воссоздания другой нити . Эта модель репликации предполагает, что две нити двойной спирали расходятся во время репликации, и каждая нить служит матрицей, с которой копируется новая комплементарная нить (рис. 9.9).

Рис. 9.9 Показана полуконсервативная модель репликации ДНК. Серым цветом обозначены исходные цепи ДНК, а синим — вновь синтезированная ДНК.

Во время репликации ДНК каждая из двух цепей, составляющих двойную спираль, служит шаблоном, с которого копируются новые цепи. Новая цепь будет комплементарна родительской или «старой» цепи. Каждая новая двойная цепь состоит из одной родительской цепи и одной новой дочерней цепи. Это известно как полуконсервативная репликация.При образовании двух копий ДНК они имеют одинаковую последовательность нуклеотидных оснований и поровну делятся на две дочерние клетки.

Поскольку эукариотические геномы очень сложны, репликация ДНК представляет собой очень сложный процесс, в котором участвуют несколько ферментов и других белков. Он протекает в три основных этапа: инициация, элонгация и терминация.

Напомним, что эукариотическая ДНК связана с белками, известными как гистоны, и образует структуры, называемые нуклеосомами. Во время инициации ДНК становится доступной для белков и ферментов, участвующих в процессе репликации.Как механизм репликации узнает, где начинается двойная спираль ДНК? Оказывается, существуют определенные последовательности нуклеотидов, называемые точками начала репликации, с которых начинается репликация. Определенные белки связываются с точкой начала репликации, в то время как фермент, называемый геликазой, раскручивает спираль ДНК. Когда ДНК раскрывается, образуются Y-образные структуры, называемые репликационными вилками (рис. 9.10). В начале репликации формируются две вилки репликации, которые расширяются в обоих направлениях по мере репликации.На эукариотической хромосоме существует несколько источников репликации, так что репликация может происходить одновременно из нескольких мест в геноме.

Во время удлинения фермент под названием ДНК-полимераза добавляет нуклеотиды ДНК к 3′-концу матрицы. Поскольку ДНК-полимераза может добавлять новые нуклеотиды только в конце остова, последовательность праймеров, которая обеспечивает эту отправную точку, добавляется с комплементарными нуклеотидами РНК. Позже этот праймер удаляют, а нуклеотиды заменяют нуклеотидами ДНК.Одна цепь, комплементарная родительской цепи ДНК, непрерывно синтезируется в направлении репликационной вилки, поэтому полимераза может добавлять нуклеотиды в этом направлении. Эта непрерывно синтезируемая цепь известна как ведущая цепь. Поскольку ДНК-полимераза может синтезировать ДНК только в направлении от 5′ к 3′, другая новая цепь собирается в короткие фрагменты, называемые фрагментами Окадзаки. Каждому из фрагментов Окадзаки для начала синтеза требуется праймер, состоящий из РНК. Цепь с фрагментами Окадзаки известна как отстающая нить.В ходе синтеза фермент удаляет РНК-праймер, который затем заменяется нуклеотидами ДНК, а промежутки между фрагментами заделываются ферментом, называемым ДНК-лигазой.

Процесс репликации ДНК можно обобщить следующим образом:

  1. ДНК раскручивается в точке начала репликации.
  2. К комплементарным родительским цепям добавляются новые основания. Одна новая прядь изготавливается непрерывно, а другая прядь изготавливается по частям.
  3. Удаляют праймеры, вместо праймеров помещают новые нуклеотиды ДНК и остов запечатывают с помощью ДНК-лигазы.
Рис. 9.10 Репликационная вилка образуется при открытии точки начала репликации, и геликаза разделяет нити ДНК. Синтезируется РНК-праймер, который удлиняется ДНК-полимеразой. На ведущей цепи ДНК синтезируется непрерывно, тогда как на отстающей цепи ДНК синтезируется короткими отрезками. Фрагменты ДНК соединяют с помощью ДНК-лигазы (не показано).

Вы изолируете клеточный штамм, в котором соединение фрагментов Оказаки нарушено, и подозреваете, что произошла мутация в ферменте, обнаруженном на репликационной вилке.Мутация какого фермента наиболее вероятна?

Репликация теломер

Поскольку эукариотические хромосомы линейны, репликация ДНК происходит в конце линии в эукариотических хромосомах. Как вы уже знаете, фермент ДНК-полимераза может присоединять нуклеотиды только в одном направлении. В ведущей цепи синтез продолжается до тех пор, пока не будет достигнут конец хромосомы; однако на отстающей цепи нет места для создания праймера для копируемого фрагмента ДНК на конце хромосомы.Это представляет проблему для клетки, потому что концы остаются непарными, и со временем эти концы становятся все короче, поскольку клетки продолжают делиться. Концы линейных хромосом известны как теломеры, которые имеют повторяющиеся последовательности, не кодирующие определенный ген. Как следствие, с каждым раундом репликации ДНК укорачиваются не гены, а теломеры. Например, у человека последовательность из шести пар оснований, TTAGGG, повторяется от 100 до 1000 раз. Открытие фермента теломеразы (рис. 9.11) помогли понять, как сохраняются концы хромосом. Теломераза прикрепляется к концу хромосомы, а на конце цепи ДНК добавляются основания, комплементарные матрице РНК. Как только матрица отстающей нити становится достаточно удлиненной, ДНК-полимераза теперь может добавлять нуклеотиды, комплементарные концам хромосом. Таким образом, концы хромосом реплицируются.

Рис. 9.11. Концы линейных хромосом поддерживаются действием фермента теломеразы.

Теломераза обычно активна в зародышевых клетках, взрослых стволовых клетках и некоторых раковых клетках. За открытие теломеразы и ее действия Элизабет Блэкберн (рис. 9.12) получила Нобелевскую премию по медицине и физиологии в 2009 году.

Рисунок 9.12 Элизабет Блэкберн, лауреат Нобелевской премии 2009 года, была ученым, открывшим принцип работы теломеразы. (кредит: посольство США, Стокгольм, Швеция)

Теломераза не активна во взрослых соматических клетках. Взрослые соматические клетки, которые подвергаются клеточному делению, по-прежнему имеют укороченные теломеры.По сути, это означает, что укорочение теломер связано со старением. В 2010 году ученые обнаружили, что теломераза может обратить вспять некоторые возрастные состояния у мышей, и это может иметь потенциал в регенеративной медицине. 1 В этих исследованиях использовались мыши с дефицитом теломеразы; у этих мышей наблюдается атрофия тканей, истощение стволовых клеток, недостаточность системы органов и нарушение реакции на повреждение тканей. Реактивация теломеразы у этих мышей вызвала удлинение теломер, уменьшение повреждения ДНК, обратимую нейродегенерацию и улучшение функционирования яичек, селезенки и кишечника.Таким образом, реактивация теломер может иметь потенциал для лечения возрастных заболеваний у людей.

Репликация ДНК у прокариот

Напомним, что прокариотическая хромосома представляет собой кольцевую молекулу с менее обширной спиральной структурой, чем у эукариотических хромосом. Эукариотическая хромосома линейна и сильно закручена вокруг белков. Хотя в процессе репликации ДНК есть много общего, эти структурные различия обусловливают некоторые различия в процессе репликации ДНК у этих двух форм жизни.

Репликация ДНК

чрезвычайно хорошо изучена у прокариот, в первую очередь из-за небольшого размера генома и большого количества доступных вариантов. Escherichia coli имеет 4,6 миллиона пар оснований в одной кольцевой хромосоме, и все они реплицируются примерно за 42 минуты, начиная с одного источника репликации и проходя по хромосоме в обоих направлениях. Это означает, что в секунду добавляется примерно 1000 нуклеотидов. Процесс идет намного быстрее, чем у эукариот.В таблице ниже приведены различия между прокариотическими и эукариотическими репликациями.

Различия между репликациями прокариот и эукариот
Собственность Прокариоты Эукариоты
Происхождение репликации Одноместный Несколько
Скорость репликации 1000 нуклеотидов/с от 50 до 100 нуклеотидов/с
Хромосомная структура круговой линейный
Теломераза Нет Подарок

Концепция в действии


Просмотрите учебник по репликации ДНК.

ДНК-полимераза может ошибаться при добавлении нуклеотидов. Он редактирует ДНК, проверяя каждую вновь добавленную базу. Неправильные базы удаляются и заменяются правильными, после чего полимеризация продолжается (рис. 9.13 и ). Большинство ошибок исправляются во время репликации, хотя, когда этого не происходит, используется механизм исправления несоответствия. Ферменты репарации несоответствия распознают ошибочно включенное основание и вырезают его из ДНК, заменяя правильным основанием (рис. 9.13 б ). При еще одном типе репарации, эксцизионной репарации нуклеотидов, двойная цепь ДНК раскручивается и разделяется, удаляются неправильные основания вместе с несколькими основаниями на 5′- и 3′-концах, которые заменяются путем копирования матрицы с помощью ДНК-полимеразы (рис. 9.13 c ). Эксцизионная репарация нуклеотидов особенно важна для коррекции димеров тимина, которые в первую очередь вызываются ультрафиолетовым светом. В димере тимина два нуклеотида тимина, соседствующие друг с другом на одной цепи, ковалентно связаны друг с другом, а не с комплементарными основаниями. Если димер не удалить и не восстановить, это приведет к мутации. Люди с дефектами в генах эксцизионной репарации нуклеотидов проявляют чрезвычайную чувствительность к солнечному свету и рано заболевают раком кожи.

Рис. 9.13. Корректура с помощью ДНК-полимеразы (а) исправляет ошибки во время репликации. При восстановлении несоответствия (б) неправильно добавленная база обнаруживается после репликации. Белки восстановления несоответствия обнаруживают это основание и удаляют его из вновь синтезированной цепи под действием нуклеазы. Промежуток теперь заполнен правильно спаренной базой.Удаление нуклеотидов (с) восстанавливает димеры тимина. При воздействии УФ-излучения тимины, лежащие рядом друг с другом, могут образовывать димеры тимина. В нормальных клетках они вырезаются и замещаются.

Исправлено большинство ошибок; в противном случае они могут привести к мутации, определяемой как постоянное изменение в последовательности ДНК. Мутации в генах репарации могут привести к серьезным последствиям, таким как рак.

ДНК

реплицируется полуконсервативным методом , в котором каждая из двух цепей родительской ДНК действует как матрица для синтеза новой ДНК.После репликации каждая ДНК имеет одну родительскую или «старую» цепь и одну дочернюю или «новую» цепь.

Репликация у эукариот начинается с нескольких источников репликации, в то время как репликация у прокариот начинается с одного источника репликации. ДНК вскрывается ферментами, в результате чего образуется репликационная вилка. Primase синтезирует РНК-праймер для инициации синтеза ДНК-полимеразой, которая может добавлять нуклеотиды только в одном направлении. Одна цепь синтезируется непрерывно в направлении репликационной вилки; это называется ведущей нитью.Другая цепь синтезируется в направлении, противоположном репликационной вилке, на коротких участках ДНК, известных как фрагменты Оказаки. Эта нить известна как отстающая нить. После завершения репликации РНК-праймеры заменяются нуклеотидами ДНК, а ДНК запечатывается с помощью ДНК-лигазы.

Концы хромосом эукариот представляют собой проблему, так как полимераза не может удлинить их без праймера. Теломераза, фермент со встроенной матрицей РНК, удлиняет концы, копируя матрицу РНК и удлиняя один конец хромосомы.Затем ДНК-полимераза может удлинить ДНК с помощью праймера. Таким образом, концы хромосом защищены. В клетках есть механизмы для восстановления ДНК, когда она повреждается или при репликации возникают ошибки. Эти механизмы включают репарацию несоответствия для замены нуклеотидов, которые связаны с некомплементарным основанием, и эксцизионную репарацию нуклеотидов, которая удаляет поврежденные основания, такие как димеры тимина.

Глоссарий

ДНК-лигаза: фермент, катализирующий соединение фрагментов ДНК вместе

ДНК-полимераза: фермент, который синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную матричной цепи

геликаза: фермент, который помогает открывать спираль ДНК во время репликации ДНК путем разрыва водородных связей

отстающая нить: во время репликации 3′-5′-цепи, цепочка, которая реплицируется короткими фрагментами и удалена от репликационной вилки

ведущая цепь: цепь, которая непрерывно синтезируется в направлении от 5′ к 3′, которая синтезируется в направлении репликационной вилки

репарация несоответствия: форма репарации ДНК, при которой некомплементарные нуклеотиды распознаются, вырезаются и заменяются правильными нуклеотидами

мутация: постоянное изменение в последовательности нуклеотидов генома

эксцизионная репарация нуклеотидов: форма репарации ДНК, при которой молекула ДНК раскручивается и разделяется в области повреждения нуклеотида, поврежденные нуклеотиды удаляются и заменяются новыми нуклеотидами с использованием комплементарной цепи, а цепь ДНК повторно запечатывается и позволил воссоединиться со своим дополнением

Фрагменты Окадзаки: фрагменты ДНК, которые синтезируются короткими участками на отстающей цепи
праймер: короткий участок нуклеотидов РНК, который необходим для инициации репликации и позволяет ДНК-полимеразе связать и начать репликацию

репликационная вилка: Y-образная структура, образующаяся во время инициации репликации

полуконсервативная репликация: метод, используемый для репликации ДНК, при котором двухцепочечная молекула отделяется, и каждая цепь действует как матрица для синтеза новой цепи, так что полученные молекулы ДНК состоят из одной новой цепи нуклеотидов и одна старая цепь нуклеотидов

теломераза: фермент, содержащий каталитическую часть и встроенную РНК-матрицу; он поддерживает теломеры на концах хромосом

теломеры: ДНК на концах линейных хромосом

Сноски

1 Mariella Jaskelioff, et al. , «Реактивация теломеразы обращает вспять дегенерацию тканей у старых мышей с дефицитом теломеразы», ​​ Nature , 469 (2011):102–7.

Репликация ДНК — Структура — Стадии репликации

Репликация ДНК, также известная как se ми-консервативная репликация , представляет собой процесс, посредством которого ДНК удваивается. Это важный процесс, происходящий внутри делящейся клетки.

В этой статье мы обсудим структуру ДНК, точные этапы репликации ДНК (инициация, удлинение и терминация) и клинические последствия , которые могут возникнуть, когда этот процесс пойдет не так.

Структура ДНК

ДНК состоит из миллионов нуклеотидов. Это молекулы, состоящие из сахара дезоксирибозы, с присоединенными к нему фосфатом и основанием (или нуклеооснованием). Эти нуклеотиды соединены друг с другом в нити посредством фосфодиэфирных связей , образуя «сахарофосфатный остов». Образующаяся связь возникает между третьим атомом углерода дезоксирибозного сахара одного нуклеотида (известного как 3’) и пятым атомом углерода другого сахара следующего нуклеотида (известного как 5’).

NB: 3′ произносится как «три простых числа», а 5′ произносится как «пять простых чисел».

Есть две нити ДНК, которые идут в противоположных или антипараллельных направлениях друг к другу. Эти нити соединены друг с другом по всей своей длине основаниями на каждом нуклеотиде. С ДНК связаны 4 различных основания: C итозин, G уанин, A денин и T гимин. В нормальных цепях ДНК цитозин связывается с гуанином, а аденин связывается с тимином.Связанные вместе две нити образуют двойную спираль .

Рис. 1. Структура РНК и ДНК

Стадии репликации ДНК

Репликацию ДНК можно представить в виде трех стадий: i инициация, элонгация и терминация

Посвящение

Синтез ДНК

инициируется в определенных точках цепи ДНК, известных как « происхождение », которые имеют определенные кодирующие области. На эти источники нацелены белки-инициаторы, которые продолжают рекрутировать больше белков, которые помогают процессу репликации, образуя комплекс репликации вокруг источника ДНК. В структуре ДНК существует множество сайтов происхождения; когда начинается репликация ДНК, эти сайты называются r репликационными вилками .

В комплексе репликации находится геликаза ДНК . Этот фермент раскручивает двойную спираль и обнажает каждую из двух цепей, чтобы их можно было использовать в качестве матрицы для репликации.Он делает это путем гидролиза АТФ, используемого для образования связей между азотистыми основаниями, тем самым разрывая связь, удерживающую две нити вместе.

ДНК-примаза — еще один фермент, играющий важную роль в репликации ДНК. Он синтезирует небольшой РНК-праймер , который действует как «стартер» для ДНК-полимеразы . Этот фермент в конечном итоге отвечает за создание и расширение новых цепей ДНК.

Удлинение

После того, как ДНК-полимераза присоединится к двум расстегнутым цепям ДНК (т.е. нитей матрицы ), он может начать синтез новых цепей ДНК, соответствующих матрицам. ДНК-полимераза способна удлинять праймер только путем добавления свободных нуклеотидов к 3′-концу .

Одна из цепочек шаблона считывается в направлении от 3’ к 5’ , поэтому новая цепочка будет сформирована в направлении от 5’ к 3’ . Эта новообразованная нить называется ведущей нитью . Вдоль ведущей цепи ДНК-примазе достаточно один раз в начале синтезировать РНК-праймер , чтобы инициировать ДНК-полимеразу.Это связано с тем, что ДНК-полимераза способна удлинять новую цепь ДНК, считывая матрицу с 3′ на 5′, синтезируя в направлении от 5′ к 3′, как отмечалось выше.

Однако другая нить матрицы ( отстающая нить ) является антипараллельной и, следовательно, читается в направлении от 5’ к 3’ . Непрерывный синтез ДНК, как и в случае ведущей цепи , должен осуществляться в направлении от 3′ к 5′, что невозможно, поскольку ДНК-полимераза не может добавлять основания к 5′-концу. Вместо этого по мере раскручивания спирали РНК-праймеры добавляются к вновь открытым основаниям на отстающей нити , и синтез ДНК происходит фрагментами, , но по-прежнему в направлении от 5′ к 3′, как и раньше.Эти фрагменты известны как фрагменты O казаки.

Прекращение

Процесс расширения новых цепей ДНК продолжается до тех пор, пока либо не останется нити ДНК-матрицы для репликации (т. Встреча двух репликационных вилок не регламентирована и происходит случайным образом по ходу хромосомы.

После завершения синтеза ДНК вновь синтезированные нити связываются и стабилизируются.Для отстающей цепи для достижения этой стабилизации необходимы два фермента: РНКаза H удаляет РНК-праймер в начале каждого фрагмента Окадзаки, а ДНК-лигаза соединяет эти фрагменты вместе, чтобы создать одну полную цепь.

Рис. 2. Схематическое изображение репликации ДНК

[старт-клинический]

Клиническая значимость — серповидноклеточная анемия

Серповидноклеточная анемия является аутосомно-рецессивным заболеванием, которое вызывается заменой одного основания , , при котором одно основание заменяется другим.В некоторых случаях замена одного основания может привести к «молчащей мутации », при которой весь ген не затрагивается, однако при таких заболеваниях, как серповидноклеточная анемия, это приводит к тому, что цепь кодирует другой белок.

В этом случае адениновое основание заменено на тиминовое основание в одном из генов, кодирующих гемоглобин; это приводит к замене глутаминовой кислоты валином. При его транскрипции в полипептидную цепь свойства, которыми он обладает, радикально изменяются, так как глутаминовая кислота гидрофильна, а валин гидрофобна. Эта гидрофобная область приводит к тому, что гемоглобин имеет аномальную структуру, которая может вызывать закупорку капилляров, приводя к ишемии и потенциальному некрозу тканей и органов — это известно как вазоокклюзионный криз.

Эти кризы обычно купируются обезболиванием, включая опиоиды и НПВП, в зависимости от тяжести. Переливание эритроцитарной массы может потребоваться в экстренных случаях, например, при закупорке легких.

Рис. 3. Различие в структуре нормальных эритроцитов и пораженных серповидно-клеточной анемией.[/подпись]

[конечный клинический]

Глава 9: Репликация ДНК – Химия

Глава 9: Репликация ДНК

9.1 Репликация ДНК является полуконсервативной

Выяснение структуры двойной спирали Джеймсом Уотсоном и Фрэнсисом Криком в 1953 году дало представление о том, как ДНК копируется в процессе репликации ДНК . Разделение цепей двойной спирали обеспечило бы две матрицы для синтеза новых комплементарных цепей, но как именно конструировались новые молекулы ДНК, все еще оставалось неясным.В одной модели полуконсервативной репликации , две нити двойной спирали расходятся во время репликации ДНК, и каждая нить служит матрицей, с которой копируется новая комплементарная нить. После репликации в этой модели каждая двухцепочечная ДНК включает одну родительскую или «старую» цепь и одну дочернюю или «новую» цепь. Также были предложены две конкурирующие модели: консервативная и дисперсионная , которые показаны на рисунке 9.1.

Рис. 9.1 Три модели репликации ДНК. В консервативной модели нити родительской ДНК (синие) оставались связанными в одной молекуле ДНК, в то время как новые дочерние нити (красные) оставались связанными во вновь образованных молекулах ДНК. В полуконсервативной модели родительских цепей разделялись и направляли синтез дочерней цепи, при этом каждая полученная молекула ДНК представляла собой гибрид родительской и дочерней цепей.В дисперсионной модели все результирующие нити ДНК имеют участки двухцепочечной родительской ДНК и участки двухцепочечной дочерней ДНК.

Рисунок Parker, N., et.al. (2019) Openstax


Мэтью Мезельсон и Франклин Шталь в 1958 году разработали эксперимент, чтобы проверить, какая из этих моделей правильно представляет репликацию ДНК (рис. 9.2). Они выращивали бактерию Escherichia coli   в течение нескольких поколений в среде, содержащей «тяжелый» изотоп азота ( 15 N), который встраивался в азотистые основания и, в конечном счете, в ДНК.Это пометило родительскую ДНК. Затем культуру E. coli перенесли в среду, содержащую 14 N, и дали ей расти в течение одного поколения. Клетки собирали и выделяли ДНК. ДНК разделяли ультрацентрифугированием, в ходе которого ДНК образовывала полосы в соответствии со своей плотностью. Ожидается, что ДНК, выращенная в среде 15 N, будет образовывать полосу в положении с более высокой плотностью, чем ДНК, выращенная в среде 14 N. Мезельсон и Шталь отметили, что после одного поколения роста в среде 14 N наблюдаемая единственная полоса была промежуточной. в положении между ДНК клеток, выращенных исключительно в 15 N или 14 N.Это предполагало либо полуконсервативный, либо дисперсионный способ репликации. Некоторым клеткам давали вырасти еще на одну генерацию при 14 Н и снова вращали. ДНК, полученная из клеток, выращенных в течение двух поколений в 14 N, образовала две полосы: одна полоса ДНК находилась в промежуточном положении между 15 N и 14 N, а другая соответствовала полосе 14 N ДНК. . Эти результаты можно было бы объяснить только в том случае, если ДНК реплицируется полуконсервативным образом.Поэтому две другие модели были исключены. В результате этого эксперимента мы теперь знаем, что при репликации ДНК каждая из двух цепочек, составляющих двойную спираль, служит шаблоном, с которого копируются новые нити. Новая цепь будет комплементарна родительской или «старой» цепи. Образовавшиеся молекулы ДНК имеют одинаковую последовательность и поровну делятся на две дочерние клетки.

Рисунок 9.2 Мезельсон и Шталь экспериментировали с E. coli , выращенной сначала в тяжелом азоте ( 15 N), а затем в среде 14 N.ДНК , выращенная при 15 N (синяя полоса), была тяжелее, чем ДНК, выращенная при 14 N (красная полоса), и при ультрацентрифугировании оседала до более низкого уровня. После одного цикла репликации ДНК оседала на полпути между уровнями 15 N и 14 N (фиолетовая полоса), исключая консервативную модель репликации. После второго раунда репликации дисперсионная модель репликации была исключена. Эти данные подтверждают полуконсервативную модель репликации.

Рисунок Паркер, Н., и другие. (2019) Openstax


Подумай об этом
  • Каким был бы вывод эксперимента Мезельсона и Шталя, если бы после первого поколения они обнаружили две полосы ДНК?
Наверх

9.2 Репликация ДНК у прокариот Репликация ДНК

хорошо изучена у бактерий, прежде всего из-за небольшого размера генома и доступных мутантов. E. coli имеет 4,6 миллиона пар оснований (Mbp) в одной кольцевой хромосоме, и все они реплицируются примерно за 42 минуты, начиная с одного начала репликации и продолжаясь по кругу в двух направлениях (т. е. в в обоих направлениях) (рис. 9.3). Это означает, что в секунду добавляется примерно 1000 нуклеотидов. Процесс довольно быстрый и происходит с небольшим количеством ошибок. E. coli имеет один ориджин репликации , называемый oriC , на одной хромосоме.Начало репликации имеет длину примерно 245 пар оснований и богато аденин-тиминовыми (АТ) последовательностями.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 9.3 Репликация прокариотической ДНК . Репликация ДНК у прокариот начинается в одном месте начала репликации, показанном на рисунке слева, и продолжается двунаправленно вокруг кольцевой хромосомы, пока репликация не завершится.Двунаправленный характер репликации создает две вилки репликации, которые активно опосредуют процесс репликации. На правом рисунке показана динамическая модель этого процесса. Красные и синие точки обозначают включение нуклеотидов дочерней цепи в процессе репликации.

Рисунки от: Даниэля Юэна из David Tribe Derivatives и Екатерины228


Обзор репликации

Открытые участки ДНК, активно реплицирующиеся, называются репликационными вилками .Все белки, участвующие в репликации ДНК, агрегируют в ответвлениях репликации , образуя комплекс репликации, называемый реплисомой (таблица 9.1 и рис. 9.4) . Репликация ДНК в модельном организме E. coli была тщательно изучена, что обеспечило основу для понимания разнообразных механизмов дупликации генома, используемых всеми организмами. В E. coli репликация ДНК инициируется в или C (рис. 9.3). oriC «плавится» под действием белка-инициатора DnaA , обнажая две нити матричной одноцепочечной ДНК, которые действуют как платформы для загрузки репликативной геликазы DnaB . Один полный гексамер DnaB загружают на каждую цепь одноцепочечной ДНК с помощью геликазного загрузчика , DnaC . Дополнительно открытая оцДНК быстро покрывается оцДНК-связывающим белком (SSB) , который защищает ДНК и блокирует дополнительную загрузку хеликазы DnaB.Каждый гексамер DnaB рекрутирует праймазу (DnaG), , которая синтезирует РНК-праймеры, используемые для инициации синтеза ДНК, вместе с субъединицами, которые составляют репликативный ДНК-полимераза III холофермент (PolIII HE) . Эти белки образуют основные реплисомы, которые копируют геном E. coli . После сборки реплисомы реплицируются в двух направлениях от oriC до тех пор, пока, в идеале, они не подвергаются запрограммированной разборке в области терминации, где они сталкиваются с сайтами ter , связанными белками Tus , которые создают «ловушки вилки репликации».После завершения репликации ДНК вновь синтезированные геномы разделяются и сегрегируются в дочерние клетки.

Таблица 9.1 Ферменты, участвующие в репликации ДНК у прокариот, E. coli

Рисунок 9.4 Общий обзор вилки репликации ДНК. В начале репликации топоизомераза II расслабляет сверхскрученную хромосому. Две вилки репликации образуются путем открытия двухцепочечной ДНК в начале координат, а геликаза разделяет нити ДНК, которые покрыты одноцепочечными связывающими белками, чтобы удерживать нити разделенными.Репликация ДНК происходит в обоих направлениях. РНК-праймер, комплементарный исходной цепи, синтезируется РНК-примазой и удлиняется ДНК-полимеразой III путем добавления нуклеотидов к 3′-ОН-концу. На ведущей цепи ДНК синтезируется непрерывно, тогда как на отстающей цепи ДНК синтезируется короткими отрезками, называемыми фрагментами Окадзаки. Праймеры РНК внутри отстающей цепи удаляются экзонуклеазной активностью ДНК-полимеразы I, а фрагменты Окадзаки соединяются ДНК-лигазой.

Рисунок Parker, N., et.al. (2019) Openstax

Вернуться к началу
Примосома в сборе

Как отмечалось выше, репликация бактериальной хромосомы инициируется в точке ori C , где белок-инициатор, DnaA, связывается, чтобы начать сборку ферментативной реплисомной машины. Ранние стадии этого процесса включают сборку примосомы , которая раскручивает две нити ДНК на вилках репликации и добавляет РНК-праймеры к ДНК-матрицам, которые будут использоваться ферментами ДНК-полимеразы для начала репликации. .После ремоделирования начала репликации, индуцированного DnaA, сборка бактериального загрузчика-зависимой примосомы происходит дискретно и включает по меньшей мере четыре различных белка (белок-инициатор, геликазу, белок-загрузчик хеликазы и праймазу), которые действуют скоординированно. и последовательно (таблица 9.1).

Область oriC прокариот содержит высококонсервативные мотивы последовательности, которые включают богатый AT бокс-домен, который служит в качестве последовательности распознавания для связывания белка-инициатора DnaA.Первоначальное связывание DnaA с oriC способствует плавлению двойной спирали ДНК и привлечению множества субъединиц DnaA, которые образуют спиральный олигомер вдоль вновь открытой одноцепочечной ДНК (оцДНК) (рис. 9.5). Белок DnaA содержит четыре основных домена. Домены III и IV являются неотъемлемой частью связывания оцДНК, в то время как домен I участвует в белок-белковых взаимодействиях. Домен II образует гибкий линкер между доменом взаимодействия с белком и ДНК-связывающими доменами.

Рис. 9.5 Сборка примосомы. Плавление ДНК при oriC и загрузка комплекса DnaB 6 –(DnaC) 6 геликаза-загрузчик на пузырь ДНК. Нижняя схема: АТФ-связанная DnaA (белок-инициатор) связывается с DnaA-боксами через домен IV, тем самым способствуя обертыванию двухцепочечной ДНК вокруг нити ДНК, вызывая торсионную деформацию двухцепочечной ДНК. Между тем, домен III ДНК связывается с одной из двух цепей оцДНК разматывающего элемента ДНК и растягивает цепь. Эти взаимодействия вызывают плавление раскручивающегося элемента ДНК, богатого AT, с образованием пузыря.В то же время связывание DnaC (загрузчика геликазы) улавливает DnaB (геликазы) в открытой конформации стопорной шайбы, чтобы обеспечить ее загрузку на оцДНК. DnaC взаимодействует с DnaA на конце филамента и служит адаптером для загрузки одного комплекса DnaB-DnaC. Неизвестно, происходит ли замыкание DnaB вокруг одноцепочечной ДНК с образованием гексамерного кольца до или одновременно с диссоциацией DnaC. Домен I DnaA взаимодействует с N-концевым доменом DnaB, помогая загрузить другой DnaB-DnaC на комплементарную цепь.Верхние вставки: спиральная нить ДНК, образованная доменами III (светло-оранжевый) и IV (бледно-зеленый) ДНК Aquifex aeolicus (PDB: 3R8F) и доменом IV ДНК E. coli (бледно-зеленый), связанными с двухцепочечной ДНК. (PDB: 1J1V). ОцДНК связывается в середине филамента DnaA посредством взаимодействия с AAA+ Доменом III DnaA.

Рисунок от: Xu, Z-Q. и Диксон, Н.Э. (2018) Curr Op Struct Biol 53:159-168


В системе E.coli белок-загрузчик геликазы, DnaC, в комплексе с АТФ связывается с гексамерной геликазой DnaB и образует комплекс DnaB-DnaC, что было подтверждено исследованиями с помощью криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ).Белок-загрузчик доставляет геликазу к расплавленным одиночным нитям ДНК нуклеопротеинового комплекса DnaA-oriC в точке начала репликации. In vivo эта доставка связана с белком-инициатором, DnaA, чей амино-концевой домен (NTD), как полагают, играет роль в загрузке хеликазы и комплекса загрузчика геликазы на oriC путем взаимодействия с геликазой, DnaB. После того, как белок-загрузчик диссоциирует от кольца хеликазы, NTD хеликазы взаимодействует с карбоксиконцевым доменом (CTD) примазы и образует функциональную примосому . Внутри примосомы геликаза (DnaB) раскручивает двухцепочечную спираль, а примаза (DnaG) синтезирует РНК-праймеры как на лидирующей, так и на отстающей цепях ДНК.

Геликазы представляют собой моторные белки, которые движутся направленно вдоль фосфодиэфирного остова нуклеиновой кислоты, разделяя две отожженные нити нуклеиновой кислоты, такие как ДНК и РНК, используя энергию гидролиза АТФ. Существует много геликаз, представляющих большое разнообразие процессов, в которых необходимо катализировать разделение цепей.Примерно 1% эукариотических генов кодируют хеликазы. Геном человека кодирует 95 неповторяющихся геликаз: 64 геликаз РНК и 31 геликаз ДНК. Многие клеточные процессы, такие как репликация ДНК, транскрипция, трансляция, рекомбинация, репарация ДНК и биогенез рибосом, включают разделение цепей нуклеиновых кислот, что требует использования геликаз. В E. coli геликаза DnaB (рис. 9.5) отвечает за раскручивание двух родительских нитей ДНК, чтобы раскрутить и отделить их друг от друга, чтобы сформировать Y-образную репликативную вилку.Вилки репликации являются фактическим местом копирования ДНК. Во время репликации внутри вилки белки, дестабилизирующие спираль, называемые одноцепочечными связывающими белками (SSB) , связываются с одноцепочечными областями, предотвращая повторное соединение цепей.

Вернуться к началу
ДНК-полимеразы

Ферменты ДНК-полимеразы необходимы для сборки дочерних цепей вдоль каждой из цепей матричной ДНК.Для всех ДНК-полимераз требуется матрица ДНК и праймер, который используется для начала процесса репликации. Праймер представляет собой короткую цепь РНК, которая помещается на матрицу ДНК с помощью фермента праймазы. Напомним также, что ДНК содержит две антипараллельные цепи и что ДНК-полимеразы могут добавлять новые нуклеотиды только в направлении от 5′ к 3′ при синтезе дочерних цепей ДНК. Поскольку обе цепи ДНК реплицируются одновременно одной и той же реплисомой, ведущая цепь , , где дочерняя цепь ДНК движется в направлении от 5′ к 3′, реплицируется непрерывно и течет в том же направлении, что и движение реплисомы. .Отстающая цепь , , лежащая в антипараллельном направлении, должна быть синтезирована в направлении, противоположном движению реплисомы, и создается с помощью коротких всплесков активности ДНК-полимеразы, приводящих к образованию Фрагментов Окадзаки вдоль матрицы прядь . Таким образом, отстающая цепь должна постоянно праймироваться короткими последовательностями РНК для поддержания образования Фрагментов Окадзаки .Затем последовательности праймеров РНК должны быть заменены ДНК, а пробелы в остове ДНК также должны быть восстановлены.

E. coli содержит в общей сложности пять ДНК-полимераз . Три из этих ферментов участвуют в репликации ДНК (ДНК-полимеразы I, II и III). ДНК-полимераза III является основной полимеразой, участвующей как в биосинтезе ведущей цепи, так и в синтезе фрагментов Окадзаки во время репликации ДНК. Холофермент ДНК-полимеразы III состоит из 10 различных белков, организованных в три функционально различных, но физически взаимосвязанных узла: (1) ядро ​​αεθ, (2) скользящий зажим β 2 и (3) δτ n γ 3-н δ’Ψ X зажимной загрузочный комплекс (рис. 9.6) . В ядре полимеразы α – субъединица полимеразы, ε – экзонуклеаза для корректировки 3’–5’, а θ – малая субъединица, стабилизирующая ε. После того, как с помощью DnaG изготовлен праймер РНК, зажим β 2 загружается на конец праймера с помощью загрузчика зажима. Субъединицы α и ε отдельно связывают зажим, каждый через короткий линейный мотив связывания зажима (CBM) с двумя симметрично связанными карманами связывания CBM β 2 . Привязанный к зажиму, Pol III способен синтезировать ДНК с высокой скоростью (∼1000 Nt/s) и с гораздо более высокой производительностью (>150 kb).

Рис. 9.6 Реплисома ДНК. (a) Стандартная хрестоматийная модель реплисомы ДНК, показывающая связанные и хорошо скоординированные процессы синтеза ведущей и отстающей цепей. ДНК-полимераза III связана с геликазой DnaB через τ-субъединицу комплексов зажим-загрузчик, и два или три ядра полимеразы одновременно реплицируют ДНК с матриц ДНК с ведущей и отстающей цепями. ОцДНК в петле отстающей цепи связывается с оцДНК-связывающими белками (SSB).(b) Недавние исследования показали, что ДНК-полимераза III E. coli легко заменяется в разветвлении и что синтез ведущей и отстающей цепей может быть не сильно связан или даже может осуществляться разными холоферментами ДНК-полимеразы III. Хеликаза DnaB также может отделяться от комплекса ДНК-полимеразы и перемещаться перед вершиной вилки.

Рисунок от: Xu, Z-Q. и Диксон, Н.Э. (2018) Curr Op Struct Biol 53:159-168


Бактериальные реплисомы представляют собой очень гибкие и мобильные машины, их динамика опосредована и контролируется сетью межбелковых взаимодействий различной силы.Многие репликативные белки либо конформационно гибкие, либо содержат гибкие или неструктурированные области, что затрудняет структурные исследования с помощью рентгеновской кристаллографии или ЯМР. Однако благодаря десятилетиям усилий структуры всех репликационных белков E. coli или их бактериальных гомологов были решены как комплексы, целые белки или домены. Недавние прорывы в области криоэлектронной микроскопии отдельных частиц (крио-ЭМ) позволили увидеть структуры, определяемые крупными субсборками реплисом, даже всей реплисомой бактериофага Т7, хотя пока только со скромным разрешением.

Крио-ЭМ-структуры комплексов E. coli Pol III core-clamp-τ C (С-концевой домен τ-субъединицы зажима-загрузчик) на ДНК праймер-матрица как в режимах полимеризации, так и в режиме корректуры. недавно решены при 8 и 6,7 Å соответственно вместе со структурами комплекса, не содержащего ДНК (рис. 9.7). Эти структуры напоминают ранее предложенные структурные модели с некоторыми сюрпризами. Например, в ДНК-связанном полимеризационном комплексе зажим β 2 становится почти перпендикулярным цепям ДНК (рис. 9.7а,б), в отличие от его наклонной конфигурации в кристаллической структуре ДНК-связанного β 2 . В то время как субъединица полимеразы Pol III α связывается с ДНК в конформации, сходной с кристаллической структурой ДНК-связанного Thermus aquaticus ( Taq ) α, расположение С-концевых доменов (αCTD, включающий домен связывания олигонуклеотидов, OB , и τ-связывание, TBD, домены) различны. В структуре Taq α и комплексе без ДНК αCTD находится близко к активному сайту полимеразы, а OB-домен расположен так, чтобы связывать и доставлять матрицу одноцепочечной ДНК в активный сайт (рис. 9.7в,г). В ДНК-связанных крио-ЭМ структурах эти домены смещены в сторону домена мизинца α, домена, который непосредственно контактирует с зажимом β 2  ; поэтому они находятся далеко от нити шаблона, входящей в активный сайт (рис. 9.7e). Домен OB контактирует с доменами мизинца и большого пальца α, а также с зажимом β 2  и ε. Сторона OB-домена, которая, как считалось, участвует в связывании матрицы одноцепочечной ДНК, теперь обращена непосредственно к двухцепочечной ДНК и находится относительно близко к ней.Кроме того, ε вклинивается между доменом большого пальца α и зажимом. Эта ранее недооцененная сеть взаимодействий, по-видимому, стабилизирует весь комплекс.

Рисунок 9.7 Структуры комплексов E. coli полимераза–зажим-τ C –ДНК. (а)  Поверхностные представления полимеризационного (слева) и корректирующего (справа) комплексов. N-концевые домены α (αNTD, остатки 1–963, окрашены у глубоководного лосося), а OB (964–1072) и τ-связывающие домены (TBD, 1173–1160) αCTD у бурого и темного лосося, соответственно, ε — желтым, β 2 — аквамариновым, θ — оранжевым и τ C — сланцевым.Полимеризационный комплекс не включает θ, а τ C  и αCTD отсутствуют в корректорском комплексе. (b)  Карикатурные изображения комплексов, показывающие различия в ДНК праймер-матрица. В полимеризационном комплексе (слева) ДНК имеет структуру В-формы, а в корректировочном комплексе ДНК праймера перетирается с концом вновь синтезированной цепи в активном центре ε. Корректирующий комплекс слегка повернут, чтобы показать ДНК в активном центре ε, а субъединица θ опущена для ясности. (c)  Поверхностное представление αNTD из ДНК-связанного полимеризационного комплекса (PDB: 5FKV), показывающее большой палец, ладонь, пальцы и домены PHP. (d)  Позиционирование αCTD в комплексах, не содержащих ДНК (PDB: 5FKU). (e)  Позиционирование αCTD в ДНК-связанном полимеризационном комплексе (PDB: 5FKV). В то время как OB-домен в комплексе, не содержащем ДНК, расположен близко к активному сайту Pol III α, в комплексе, связанном с ДНК, он находится далеко. Домен OB окрашен в морской цвет, а домен TBD — в пурпурный.αNTD (серый) в двух комплексах показывает относительно небольшие изменения по сравнению с αCTD.

Рисунок от: Xu, Z-Q. и Диксон, Н.Э. (2018) Curr Op Struct Biol 53:159-168


В целом, при связывании с ДНК в комплексе ДНК-полимеразы III происходят значительные конформационные изменения, которые заставляют хвост полимеразы перемещаться от взаимодействия с зажимом в ДНК-связанном состоянии к положению на 35 Å от зажима в состояние отсутствия ДНК (видео 9.1). Было высказано предположение, что это большое конформационное изменение может помочь полимеразе действовать как переключатель, облегчающий синтез отстающей цепи.На отстающей нити полимераза перемещается на новый праймированный сайт каждые ∼1000 п.н. Для этого полимеразе необходимо высвободить зажим и ДНК. Подобное переключателю движение хвоста полимеразы может играть роль в высвобождении и последующем изменении положения полимеразы на конце фрагмента Окадзаки.

 

Видео 9.1 Связывание ДНК вызывает большие конформационные изменения в комплексе ДНК-полимеразы III. На видео показано линейное преобразование состояния без ДНК в состояние со связью с ДНК, демонстрирующее большое изменение конформации между двумя состояниями.Зеленая субъединица представляет собой β-зажим. α-субъединица показана оранжевым цветом с остатками активного центра, выделенными пурпурным цветом, α-C-концевой домен (α-CTD показан коричневым цветом, ε-субъединица желтым цветом, а τ-хвост показан синим цветом

Видео от: Fernandez-Liero, R., et al. (2015) eLife 4: e11134


Корректурный комплекс очень похож на комплекс полимеризации с небольшими перемещениями отдельных белковых компонентов (рис. 9.7а,б). Наиболее значительные движения включают вращение и наклон дуплексной ДНК относительно плоскости β 2 , блокируя ДНК на внутренней поверхности кольца β 2 (рис. 9.7б). Домен большого пальца полимеразы и ε также движутся к ДНК. Домен большого пальца вклинивается между двумя цепями ДНК с несовпадающими парами оснований, что приводит к сильно искаженному и изношенному ДНК-субстрату. Таким образом, вновь синтезированная цепь может достигать активного сайта нуклеазы ε для редактирования. Учитывая, что корректорский комплекс очень похож на полимеризационные комплексы, а дуплексная ДНК с двумя несовпадающими парами оснований имеет тенденцию к изнашиванию, предполагается, что ε работает пассивно, ожидая, пока ДНК достигнет своего нуклеазно-активного центра, когда встраивается не тот нуклеотид, а не активно реагировать на событие неправильного включения.В дополнительном биофизическом исследовании одной молекулы было показано, что ядро ​​Pol III, связанное зажимом, является удивительно стабильным и процессивным в режиме корректуры в отсутствие поступающих dNTP.

Долгое время считалось, что бактериальные реплисомы представляют собой хорошо скоординированные высокопроизводительные машины, способные копировать всю хромосому без диссоциации. Считалось, что два или три ядра полимеразы одного и того же HE E. coli Pol III синтезируют обе цепи ДНК, при этом полимераза отстающей цепи неоднократно используется для синтеза нового фрагмента Окадзаки, как описано выше.Обсуждается, что рециркуляция полимеразы отстающей цепи запускается различными механизмами столкновения или передачи сигналов хорошо контролируемым образом, который, вероятно, включает движение области τ-хвоста. Однако недавние исследования показывают, что бактериальные полимеразы также легко обмениваются репликационными вилками и что синтез ведущей и отстающей цепей ДНК не всегда может быть тесно связан. На рис. 9.6b изображена предлагаемая модель этого обмена.

В целом, ДНК-полимераза III является высокопроцессивным ферментом, включающим от 600 до 1000 оснований в секунду, при этом на одно событие связывания включается более 100 000 оснований, а частота ошибок составляет примерно 1 на миллион.

ДНК-полимераза I помогает в процессе синтеза отстающих цепей, поскольку эта полимераза удаляет РНК-праймеры и включает ДНК на их место. ДНК-полимераза II, хотя и не совсем понятна, считается, что она играет роль редактирования после синтеза отстающей цепи ДНК-полимеразой I. ДНК-полимеразы I и II также играют роль в репарации ДНК, как и ДНК-полимеразы IV и В .

ДНК-полимераза I аналогична ДНК-полимеразе III в том, что она обладает полимеразной активностью от 5′ до 3′, а также экзонуклеазной активностью от 3′ до 5′, которая обеспечивает как процессивность, так и функцию корректуры ДНК фермента.Кроме того, ДНК-полимераза I также содержит большой белковый домен, называемый фрагментом Кленова , который проявляет экзонуклеазную активность от 5′ до 3′ (рис. 9.8). Экзонуклеазная активность с 5′ по 3′ отвечает за удаление РНК-праймеров вдоль отстающей цепи. Процессивность этого фермента позволяет полимеразе заполнять эти промежутки ДНК. Однако ДНК-полимераза I не может соединить остов вновь синтезированных фрагментов Окадзаки с нижележащим фрагментом.Восстановление разрывов в остове ДНК опосредуется ферментом ДНК-лигазы .

Рисунок 9.8 Структура E. coli ДНК-полимераза I. ДНК-полимераза I проявляет 5′-3′-полимеразную активность и 3′-5′-экзонуклеазную активность, опосредуя процессивность и корректорскую активность фермента. ДНК-полимераза I также обладает экзонуклеазной активностью от 5′ до 3′, расположенной в специальном домене фермента, называемом фрагментом Кленова.Этот домен отвечает за удаление последовательностей РНК-праймеров из вновь синтезированной ДНК. Затем полимеразная активность с 5′ на 3′ используется для замены РНК-праймера на ДНК. Экзонуклеазная активность от 3′ до 5′ обеспечивает включение правильных оснований.

Рисунок из: Goodsell, DS (2015) RCSD PDB-101 Molecule of the Month

Вернуться к началу

Ферменты ДНК-лигазы запечатывают разрывы в остове ДНК, возникающие во время репликации ДНК, повреждения ДНК или в процессе восстановления ДНК.Биохимическая активность ДНК-лигазы приводит к запечатыванию разрывов между 5′-фосфатным и 3′-гидроксильным концами в цепи ДНК. ДНК-лигазы были дифференцированы как АТФ-зависимые или NAD + -зависимые в зависимости от кофактора (или ко-субстрата), который используется во время их реакции. Как правило, в организме обнаруживается более одного типа ДНК-лигазы. Как показано на рис. 9.9, фермент ДНК-лигаза ковалентно модифицируется добавлением фрагмента АМФ к остатку лизина на ферменте.AMP происходит из кофактора АТФ или НАДН. Нижний 5′-фосфат в месте разрыва ДНК способен опосредовать нуклеофильную атаку на комплекс AMP-фермент, вызывая перенос AMP в 5′-фосфатное положение ДНК. AMP служит хорошей уходящей группой для нуклеофильной атаки 3′-OH выше по течению с помощью 5′-фосфата, чтобы запечатать основу ДНК и высвободить AMP.

Рис. 9.9 Реакция ДНК-лигазы. ДНК-лигазы катализируют решающий этап соединения разрывов в дуплексной ДНК во время репарации, репликации и рекомбинации ДНК и требуют либо аденозинтрифосфата (АТФ), либо никотинамидадениндинуклеотида (НАД+) в качестве кофактора.На изображении вверху слева показана ДНК-лигаза I, восстанавливающая хромосомные повреждения. Три видимые белковые структуры: ДНК-связывающий домен (DBD), который связан с малой бороздкой ДНК как выше, так и ниже поврежденного участка. OB-складчатый домен (OBD) немного раскручивает ДНК на протяжении шести пар оснований и обычно участвует в связывании нуклеиновых кислот. Домен аденилирования (AdD) содержит ферментативно активные остатки, которые соединяют разорванные нуклеотиды вместе, катализируя образование фосфодиэфирной связи между фосфатом и гидроксильной группой.Вполне вероятно, что все ДНК-лигазы млекопитающих (лигазы I, III и IV) имеют сходную кольцеобразную архитектуру и способны распознавать ДНК сходным образом. Диаграмма вверху справа представляет собой структуру с высоким разрешением E. coli LigA в комплексе с аденилированной ДНК с разрывами из PDB 2OWO, визуализированную с помощью UCSF Chimera. Различные домены обозначены разными цветами и относятся к указанным доменам Pfam. Нижняя диаграмма изображает каталитический механизм ДНК-лигазы I.Кофактор АТФ образует ковалентную связь с остатком лизина в положении α-фосфата, вызывая высвобождение дифосфата. AMP используется для активации 5′-фосфатной группы, позволяя расположенной выше 3′-ОН-группе опосредовать атаку на центральный атом фосфора. AMP служит уходящей группой.

Рисунок вверху слева: Элленбергер Т. из Медицинской школы Вашингтонского университета, Сент-Луис, Миссури. Рисунок справа: Перголицци Г., Вагнер Г.К. и Боуотер Р.П. (2016) Biosci Rep 36( 5) e00391, а нижний рисунок: Showalter, A.(2002)


Краткое описание процесса репликации ДНК показано в видео 9.2

Видео 9.2 Обзор процесса репликации ДНК

Видео из: Yourgenome, анимация Polymime Animation Company, Ltd

Вернуться к началу
Ферменты топоизомеразы

Раскручивание двухцепочечной спирали на репликационной вилке создает натяжение в ДНК в виде положительных суперспиралей перед репликационной вилкой.Ферменты, называемые топоизомеразами , противодействуют этому, вводя отрицательные суперспирали в ДНК, чтобы снять это напряжение в спиральной молекуле во время репликации. Есть четыре известных фермента топоизомеразы, обнаруженные в E. coli , которые делятся на два основных класса: топоизомеразы типа I и топоизомеразы типа II (рис. 9.10). Топоизомераза I и III представляют собой топоизомеразы типа I, тогда как ДНК-гираза и топоизомераза IV представляют собой топоизомеразы типа II.

Рис. 9.10 Структуры топоизомеразы типа I и типа II . (A) Кристаллическая структура топоизомеразы типа I, показанная синим цветом, связанная с ДНК, показанная оранжевым и желтым цветом. (B) Кристаллическая структура топоизомеразы II типа. Топоизомераза II образует тетрамерную структуру, показанную зеленым и синим цветом. Кофакторы АТФ (розовые) показаны связанными с ферментом.

Goodsell, DS (2015) RCSD PDB-101 Молекула месяца


Топоизомеразы I типа снимают напряжение, возникающее при скручивании и раскручивании ДНК.Один из способов сделать это — надрезать или надрезать одну нить двойной спирали ДНК (рис. 9.11). 5′-фосфорильная сторона цепи ДНК с разрывом остается ковалентно связанной с ферментом по остатку тирозина, в то время как 3′-конец удерживается ферментом нековалентно. Топоизомеразы типа I вращают или закручивают 3′-конец ДНК вокруг интактной цепи ДНК. Это освобождает ДНК от перекручивания и эффективно снимает напряжение. Фермент завершает реакцию, повторно запечатывая фосфодиэфирную основу или лигируя разорванную цепь обратно вместе.В целом, только одна цепь ДНК разрывается во время механизма реакции, и во время реакции требуется АТФ. Фермент E. coli Topo I может удалять только отрицательные суперспирали ДНК, но не положительные. Таким образом, этот фермент не участвует в снятии положительной суперспирализации, вызванной геликазой ДНК во время репликации. Это отличается от эукариотического Topo I, который может уменьшать как положительную, так и отрицательную суперспирализацию. Хотя Е.coli Топоизомераза I не принимает непосредственного участия в снятии напряжения, вызванного репликацией ДНК, она необходима для жизнеспособности E. coli . Считается, что он помогает сбалансировать действия топоизомеразы типа II и помогает поддерживать оптимальную плотность суперспирализации в хромосомной ДНК. Таким образом, считается, что Topo I помогает поддерживать гомеостатический баланс сверхспирализации хромосом в E. coli. Topo III, который также является топоизомеразой типа I, по-видимому, играет роль в декатенации дочерних хромосом во время репликации ДНК, но не играет роли в ослаблении суперспирализации.

 

Рис. 9.11. Реакция топоизомеразы I типа. Во время реакции топоизомеразы I типа разрывают одну цепь ДНК. Один конец разорванной ДНК ковалентно присоединен к ферменту, показанному светло-зеленым цветом на нижних диаграммах. Другой конец удерживается нековалентно и вращается вокруг двойной спирали, чтобы раскрутить суперспираль и расслабить ДНК. Как только снимается напряжение сверхспирализации, остов вновь запечатывается и высвобождается фермент топоизомераза I.

Ремикс рисунка: Notahelix and JoKalliauer,  и Национальный исследовательский институт генома человека


Топоизомеразы типа II выполняют множество функций внутри клетки. Они могут увеличивать или уменьшать натяжение спирали внутри ДНК, а также могут распутывать или декатанировать ДНК, которая запуталась в другой нити (рис. 9.12). Он делает это более опасным методом, чем их аналоги типа I, разрывая обе нити ДНК во время их механизма реакции. Фермент ковалентно присоединяется к обеим сторонам разрыва, в то время как другая спираль ДНК проходит через разрыв.Двойной разрыв нити затем повторно запечатывается.

Рис. 9.12. Реакция топоизомераз II типа. Предлагаемый цикл реакции топоизомеразы типа II иллюстрируется топоизомеразой IV. Субъединицы топоизомеразы IV обозначены серым, голубым и желтым цветом. Ворота или G-ДНК выделены зеленым цветом, а транспортируемая или Т-ДНК — лиловым. АТФ, связанный с доменами АТФазы, обозначен красной точкой. На этапе 1 G-ДНК связывается с ферментом. АТФ и сегмент Т-ДНК связываются с ферментом на этапе 2.На этапе 3 G-ДНК расщепляется, и Т-ДНК проходит через разрыв. Нацеленные на лекарство домены в комплексе топоизомеразы типа II выделены в подразделах A, B и C с примерами в правой части рисунка.

Рисунок изменен по материалам: Laponogov, I., et al. (2018) Nature Communications 9:2579.


ДНК-гираза — это фермент топоизомераза II типа, который в первую очередь участвует в снятии положительного напряжения сверхспирализации, возникающего из-за раскручивания геликазы на репликационной вилке.Топоизомеразы типа II, особенно Topo IV, также решают ключевую механистическую проблему, с которой сталкиваются бактериальные реплисомы во время терминации репликации ДНК. Круговая природа бактериальной хромосомы диктует, что пара реплисом, которые инициируются из одного источника репликации, в конечном итоге сойдутся друг с другом в ориентации «голова к голове». ДНК-гиразы, которая обычно удаляет положительные суперспирали, становится ограниченной из-за уменьшающегося количества доступной матричной ДНК.Вместо этого суперспирали могут диффундировать позади реплисом, образуя прекатенаны между вновь реплицированной ДНК; в E.coli они должны быть разрешены с помощью Topo IV, чтобы произошло расхождение хромосом.

Белки Tus и терминация репликации

Правильное завершение репликации ДНК важно для стабильности генома. E. coli  репликация заканчивается в области, противоположной или C . Существует десять сайтов терминации 23 п.н.13). Tus связывается с Ter с высокой аффинностью в соотношении 1:1, а Tus- Ter может дополнительно образовывать очень стабильный «замковый» комплекс, если цитозин-6 строго консервативной пары оснований G–C(6) Ter высвобождается из дуплекса ДНК и связывается в предварительно сформированном цитозин-связывающем кармане Tus (рис. 9.13b). Комплекс замка Tus– Ter полярен с разрешающей стороной, которая позволяет реплисоме беспрепятственно проходить, и не разрешающей стороной, которая может блокировать реплисому. Десять сайтов Ter организованы в виде двух противоположно ориентированных групп по пять, что позволяет реплисоме проходить первую группу и блокироваться во второй.Это гарантирует, что две вилки репликации сходятся в конечной области для правильного расхождения хромосом.

Рисунок 9.13 Механизмы блокировки реплисом комплексами терминации репликации Tus– Ter . (a)  Схематическое изображение хромосомы E. coli с указанием положения сайтов oriC и Ter . Вилка, движущаяся по часовой стрелке, проходит через разрешающие участки, показанные зеленым, и останавливается в запрещенных участках, показанных красным. (b) Схематическое изображение структуры «запертого» комплекса Tus- Ter (PDB: 2I06), показывающее цитозин-6 в его связывающем кармане в Tus. (c)  Взаимодействия остатка Arg198 Tus с обеими цепями Ter в комплексах с двухцепочечным Ter дикого типа (PDB: 2I05, слева) и комплексом Tus- Ter UGLC (GC(6 ) пара оснований перевернута; PDB: 4XR3, справа).

Рисунок от: Xu, Z-Q. и Диксон, Н.Э. (2018) Curr Op Struct Biol 53:159-168

Вернуться к началу

Для копирования своих нуклеиновых кислот плазмиды и вирусы часто используют варианты репликации ДНК, описанные для геномов прокариот.Здесь мы сосредоточимся на одном стиле, известном как метод катящегося круга .

Репликация по катящемуся кругу

В то время как многие бактериальные плазмиды реплицируются путем процесса, аналогичного тому, что используется для копирования бактериальной хромосомы, других плазмидов, несколько бактериофаги , а около вирусов эузариотов Использование Rolling Replation Replication (Рисунок 9.14). Циркулярная природа плазмид и циркуляризация некоторых вирусных геномов при заражении делают это возможным. Репликация по катящемуся кругу начинается с ферментативного разрыва одной нити двухцепочечной кольцевой молекулы в сайте двухцепочечного происхождения (dso) . У бактерий ДНК-полимераза III связывается с 3′-ОН-группой цепи с разрывом и начинает однонаправленную репликацию ДНК, используя цепь без разрыва в качестве матрицы, вытесняя при этом цепь с разрывом.Завершение репликации ДНК в месте исходного разрыва приводит к полному смещению цепи с разрывом, которая затем может рециркулировать в одноцепочечную молекулу ДНК. Затем РНК-примаза синтезирует праймер для инициации репликации ДНК в месте одноцепочечной молекулы ДНК (оцДНК) одноцепочечной ДНК (sso), в результате чего получается двухцепочечная ДНК (дцДНК), идентичная другой молекуле. кольцевая молекула ДНК.

 

Рис. 9.14 Репликация по катящемуся кругу. Процесс репликации по катящемуся кругу инициируется одноцепочечным разрывом в ДНК. Внутри прокариот ДНК-полимераза III используется для создания дочерней цепи. ДНК-лигаза воссоединяется с разрывами в остове и обеспечивает инициацию синтеза ДНК второй дочерней цепи.

Рисунок Parker, N., et.al. (2019) Openstax

Вернуться к началу

9.4 Репликация ДНК у эукариот
Клеточный цикл

Клеточный цикл представляет собой упорядоченную серию событий, включающих рост и деление клеток, в результате которых образуются две новые дочерние клетки.Клетки на пути к клеточному делению проходят ряд точно рассчитанных по времени и тщательно регулируемых стадий роста, репликации ДНК и деления, в результате которых образуются две генетически идентичные клетки. Клеточный цикл состоит из двух основных фаз: интерфазы и митотической фазы (рис. 9.15). Во время интерфазы клетка растет, и ДНК реплицируется. Во время митотической фазы реплицированная ДНК и содержимое цитоплазмы разделяются, и клетка делится.Посмотрите это видео о клеточном цикле: http://openstax.org/l/biocellcyc

Рис. 9.15 Схема клеточного цикла.  Ячейка проходит через ряд фаз упорядоченным образом. Во время интерфазы G 1 включает рост клеток и синтез белка, S фаза включает репликацию ДНК и репликацию центросомы, а G 2 включает дальнейший рост и синтез белка. Митотическая фаза следует за интерфазой. Митоз — это деление ядра, во время которого удвоенные хромосомы разделяются и распределяются в дочерние ядра.Обычно клетка делится после митоза в процессе, называемом цитокинезом, при котором цитоплазма делится и образуются две дочерние клетки.

Рисунок Fowler, S., et.al. (2013) Openstax


Во время интерфазы в клетке происходят нормальные процессы, а также подготовка к клеточному делению. Для перехода клетки из интерфазы в митотическую фазу необходимо выполнение многих внутренних и внешних условий. Три стадии интерфазы называются G 1 , S и G 2 .Первую стадию интерфазы называют фазой G 1 , или первым промежутком, потому что видны небольшие изменения. Однако на стадии G 1 клетка достаточно активна на биохимическом уровне. Клетка накапливает строительные блоки хромосомной ДНК и связанных с ней белков, а также накапливает достаточные запасы энергии для выполнения задачи репликации каждой хромосомы в ядре. На протяжении всей интерфазы ядерная ДНК остается в полуконденсированной конфигурации хроматина.В фазе S (фаза синтеза) репликация ДНК приводит к образованию двух идентичных копий каждой хромосомы — сестринских хроматид — прочно прикрепленных к области центромеры (рис. 9.16Б). На этой стадии каждая хромосома состоит из двух сестринских хроматид и является удвоенной хромосомой. Центросома удваивается во время S-фазы. Две центросомы дадут митотическое веретено, аппарат, управляющий движением хромосом во время митоза.У млекопитающих центросома состоит из пары палочковидных центриолей , расположенных под прямым углом друг к другу. Центриоли помогают организовать клеточное деление. Центриоли отсутствуют в центросомах многих эукариотических видов, таких как растения и большинство грибов.

Рисунок 9.16 Структура хромосом человека. (A) Спектральная кариограмма нормальной женщины. Всего у человека 23 пары хромосом, всего 46. Каждая пара хромосом называется гомологичными хромосомами , поскольку они содержат копии одних и тех же областей генов.Каждая из гомологичных пар хромосом окрашена в один и тот же цвет. Хромосомы показаны в их конденсированном, нереплицированном состоянии. (B) Показывает схематическую диаграмму одной хромосомы до (нижняя диаграмма) и после (верхняя диаграмма) репликации. При репликации идентичные копии хромосомы называются сестринскими хроматидами и соединяются вместе в структуре центромер .

Рисунок A из: Национального исследовательского института генома человека и Рисунок B из: Wiki Школы биомедицинских наук


В фазе G 2 , или втором промежутке, клетка пополняет запасы энергии и синтезирует белки, необходимые для манипулирования хромосомами.Некоторые клеточные органеллы дублируются, а цитоскелет демонтируется, чтобы обеспечить ресурсы для митотического веретена. Во время G 2 может наблюдаться дополнительный рост клеток. Окончательные приготовления к митотической фазе должны быть завершены до того, как клетка сможет вступить в первую стадию митоза. Для образования двух дочерних клеток необходимо разделить содержимое ядра и цитоплазмы. Митотическая фаза представляет собой многоэтапный процесс, в ходе которого дуплицированные хромосомы выравниваются, разделяются и перемещаются к противоположным полюсам клетки, а затем клетка делится на две новые идентичные дочерние клетки.Первая часть митотической фазы, митоз, , состоит из пяти стадий, на которых завершается деление ядра. Вторая часть митотической фазы, называемая цитокинез , представляет собой физическое разделение цитоплазматических компонентов на две дочерние клетки.

Если клетки не проходят через одну из фаз интерфазы или митоза, говорят, что они находятся в G или в состоянии покоя. Если клетки входят в G 0 постоянно, говорят, что они вступили в стадию репликативного старения и больше не будут поддерживаться в течение длительного времени в организме.

Продвижение клеток по клеточному циклу требует скоординированных действий специфических протеинкиназ, известных как циклинзависимые киназы . Циклин-зависимые киназы обычно обозначаются аббревиатурой CDK или CDC-белками. Для активации белков CDK/CDC требуется связывание регуляторного белка циклина (рис. 9.17). Основные циклиновые белки, которые управляют клеточным циклом в прямом направлении, экспрессируются только в отдельные моменты времени в течение клеточного цикла. При активации аналогом циклина ферменты CDK/CDC фосфорилируют нижележащие мишени, участвующие в развитии клеточного цикла.Например, первичный комплекс циклин-CDK, участвующий в инициации репликации ДНК во время S-фазы, представляет собой комплекс CyclinE-CDK2. CDK2 активируется экспрессией и связыванием Cyclin E во время поздней фазы G1. Это заставляет CDK2 фосфорилировать нижележащие мишени, включая белок-супрессор опухоли ретинобластомы, pRb. pRB обычно связывает и ингибирует активность транскрипционных факторов семейства E2F. После высвобождения факторов транскрипции E2F из pRb, E2F активируют транскрипцию генов, участвующих в репликации ДНК, что приводит к переходу клеток в S-фазу.

Рис. 9.17 Циклинзависимые киназы (CDK) и их регуляторные субъединицы циклина. (A) Показаны комплексы CDK-циклин с прямыми функциями в регуляции клеточного цикла. CDK3/циклин C управляет входом в клеточный цикл с G 0 . Комплексы CDK4/6/циклин D инициируют фосфорилирование белка ретинобластомы (pRb) и способствуют активации комплекса CDK2/циклин E. В конце G1 комплекс CDK2/циклин E завершает фосфорилирование и инактивацию pRb, что высвобождает факторы транскрипции E2F, и происходит переход G1/S.Репликация ДНК происходит в S-фазе. Комплекс CDK2/циклин А регулирует прохождение через фазу S, а комплекс CDK1/циклин А через фазу G2 при подготовке к митозу (М). Митоз инициируется комплексом CDK1/циклин B. (B) показывает циклический характер экспрессии циклина во время развития клеточного цикла. Изобилие циклина регулируется экспрессией транскрипции и быстрой деградацией белка. Таким образом, их биологическая активность нацелена на очень специфические моменты времени во время развития клеточного цикла.

Рисунок А от: Алим, Э.и Арсечи, Р.Дж. (2015) Фронт. Cell и Dev 3 (16) и рисунок B из: Cyclinexpression_waehrend-Zellzyklus

Вернуться к началу
Инициация репликации

Организация происхождения, спецификация и активация у эукариот более сложны, чем в царствах бактерий или архей, и значительно отклоняются от парадигмы, установленной для инициации репликации прокариот. Большие размеры генома эукариотических клеток, которые варьируются от 12 Мбн в S . cerevisiae t o 3 Гбит/с у человека, необходимо, чтобы репликация ДНК начиналась с нескольких сотен (у почкующихся дрожжей) до десятков тысяч (у человека) точек начала репликации для завершения репликации ДНК всех хромосом в течение каждого клеточного цикла (рис. 9.18).

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 9.18. Эукариотические хромосомы, как правило, линейны, и каждая содержит множественные точки начала репликации .Рисунок слева представляет собой графическое представление эукайотических источников репликации, а изображение справа представляет собой изображение криоэлектронной микрофотографии

.

Рисунок слева взят из: Parker, N. et al. и цифра справа от: Fritensky, B. and Brien, N


За исключением S . cerevisiae и родственные виды Saccharomycotina эукариотического происхождения не содержат элементов согласованной последовательности ДНК, но на их расположение влияют контекстуальные сигналы, такие как локальная топология ДНК, структурные особенности ДНК и окружение хроматина.Тем не менее, эукариотическая функция происхождения по-прежнему зависит от консервативного комплекса белка-инициатора для загрузки репликативных геликаз на ДНК во время поздних фаз M и G1 клеточного цикла, шаг, известный как лицензирование происхождения . В отличие от своих бактериальных аналогов, репликативные хеликазы у эукариот загружаются в исходную дуплексную ДНК в неактивной двойной гексамерной форме, и только часть из них (10–20% в клетках млекопитающих) активируется во время любой данной S-фазы, события, которые обозначаются как происхождение стрельбы .Таким образом, местоположение активного эукариотического происхождения определяется, по крайней мере, на двух различных уровнях: лицензирование происхождения для маркировки всех потенциальных мест происхождения и возбуждение происхождения для выбора подмножества, которое обеспечивает сборку механизма репликации и инициацию синтеза ДНК. Дополнительные лицензированные источники служат в качестве резервных и активируются только при замедлении или остановке ближайших вилок репликации, гарантируя, что репликация ДНК может быть завершена, когда клетки сталкиваются со стрессом репликации. Вместе избыток лицензированного происхождения и жесткий контроль клеточного цикла лицензирования происхождения и запуска воплощают две важные стратегии предотвращения недостаточной и чрезмерной репликации и поддержания целостности эукариотических геномов.

Ферменты эукариотической ДНК-полимеразы

Подобно репликации ДНК у прокариот, репликация ДНК у эукариот происходит в противоположных направлениях между двумя новыми цепями репликационной вилки. У эукариот две репликативные полимеразы синтезируют ДНК в противоположных ориентациях (рис. 9.16). Полимераза ε (эпсилон) синтезирует ДНК непрерывным образом, поскольку она «направлена» в том же направлении, что и раскручивание ДНК. Подобно репликации бактерий, эта цепь известна как ведущая цепь . Напротив, полимераза δ (дельта) синтезирует ДНК на противоположной матричной цепи фрагментированным или прерывистым образом, и эта цепь называется отстающей нитью . Прерывистые участки продуктов репликации ДНК на отстающей цепи известны как фрагменты Оказаки и имеют длину от 100 до 200 оснований в эукариотических репликативных вилках. Из-за «отстающей» природы отстающая цепь обычно содержит более длинный участок оцДНК, который покрыт одноцепочечными связывающими белками, которые стабилизируют матрицы оцДНК, предотвращая образование вторичной структуры или другие транзакции на открытой оцДНК.У эукариот стабилизация одноцепочечной ДНК поддерживается гетеротримерным комплексом, известным как репликационный белок А (RPA) (рис. 9.19). Каждому фрагменту Оказаки предшествует РНК-праймер, который вытесняется процессией следующего фрагмента Оказаки во время синтеза. В эукариотических клетках небольшое количество сегмента ДНК непосредственно перед РНК-праймером также смещается, создавая лоскутную структуру. Затем этот лоскут расщепляется эндонуклеазами (такими как Fen1, обсуждается позже).На репликационной вилке разрыв в ДНК после удаления лоскута запечатывается с помощью ДНК-лигазы I . Из-за относительно короткой природы эукариотического фрагмента Окадзаки синтез репликации ДНК, происходящий прерывисто на отстающей цепи, менее эффективен и занимает больше времени, чем синтез лидирующей цепи.

 

Рис. 9.19 Эукариотический реплисомный комплекс координирует репликацию ДНК. Репликация на лидирующей и отстающей цепях осуществляется Pol ε и Pol δ соответственно.Многие реплисомные факторы (в том числе FPC [защитный комплекс вилки], Claspin, And1 и RFC [загрузчик зажима фактора репликации С]) отвечают за регуляцию функций полимеразы и координацию синтеза ДНК с раскручиванием матричной цепи с помощью Cdc45-MCM [мини- -обслуживание хромосом]-GINS [go-ichi-ni-san]. Реплисомы также связаны с белками контрольных точек в качестве механизмов наблюдения за репликацией ДНК и целостностью генома.

Рисунок из: Lemanm A.R. и Ногучи, Э. (2013) Гены 4(1):1-32


На эукариотической вилке репликации три различных репликативных полимеразных комплекса вносят вклад в каноническую репликацию ДНК: α, δ и ε.Эти три полимеразы необходимы для жизнеспособности клетки. Поскольку ДНК-полимеразам требуется праймер для начала синтеза ДНК, сначала полимераза α (Pol α) действует как репликативная праймаза. Pol α связан с РНК-примазой, и этот комплекс выполняет задачу праймирования путем синтеза праймера, который содержит короткий участок РНК ~ 10 нуклеотидов, за которым следуют от 10 до 20 оснований ДНК. Важно, что это праймирующее действие происходит при инициации репликации в ориджинах, чтобы начать синтез ведущей нити, а также на 5′-конце каждого фрагмента Оказаки на отстающей нити.

Однако Pol α не способен продолжать репликацию ДНК. Из исследований in vitro было замечено, что репликация ДНК должна быть «передана» другой полимеразе для продолжения синтеза. Для переключения полимеразы требуются зажимные загрузчики. Первоначально считалось, что Pol δ выполняет репликацию ведущей цепи, а Pol α завершает каждый фрагмент Окадзаки на отстающей цепи. Используя варианты мутаторной полимеразы и картирование событий неправильного включения нуклеотидов, Kunkel и др. обнаружили, что мутации Pol ε и Pol δ приводят к несовпадающему включению нуклеотидов только в лидирующие и отстающие нити, соответственно.Таким образом, нормальная репликация ДНК требует скоординированных действий трех ДНК-полимераз: Pol α для праймирующего синтеза, Pol ε для репликации лидирующей цепи и Pol δ для образования фрагментов Оказаки во время синтеза отстающей цепи (рис. 9.16).

У эукариот ДНК-полимеразы сгруппированы в семь семейств (A, B, C, D, X, Y и RT). Кристаллические структуры трех ядерных репликативных ДНК-полимераз показывают, что они принадлежат к семейству В (рис. 9.17). Все три репликативные ДНК-полимеразы представляют собой многосубъединичные ферменты (таблица 9.2)

Таблица 9.2 Субъединицы основных эукариотических репликативных ДНК-полимераз

Таблица из: Doublié, S. and Zahn, K.E. (2014) Фронт. Микробиол 5:444

Вернуться к началу

Все полимеразы семейства B состоят из пяти субдоменов: пальцев, большого пальца и ладони, которые составляют ядро ​​фермента, а также экзонуклеазного домена и N-концевого домена (NTD). Ладонь, высококонсервативная складка, состоящая из четырех антипараллельных β-цепей и двух спиралей, содержит два строго консервативных каталитических аспартата, расположенных в мотиве A, D XXLYPS, и мотиве C, DT D S (рис. 9.20). Эта складка является общей для очень большой группы ферментов, включая ДНК- и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, CRISPR-полимеразу и даже обратные (3’–5′) трансферазы. Напротив, субдомены большого пальца и пальцев демонстрируют существенно большее структурное разнообразие. Пальцы претерпевают конформационные изменения при связывании ДНК и правильного входящего нуклеотида. Это движение позволяет остаткам в субдомене пальцев вступать в контакт с нуклеотидом в зарождающейся паре оснований. Большой палец удерживает дуплекс ДНК во время репликации и играет роль в процессивности.Экзонуклеазный домен обладает 3′-5′ корректирующей активностью, которая удаляет ошибочно включенные нуклеотиды. NTD, по-видимому, лишен каталитической активности. В pol δ NTD включает три мотива: один имеет топологию, напоминающую складку OB, мотив связывания одноцепочечной ДНК, а другой несет мотив связывания РНК (мотив распознавания РНК или RRM). NTD, вероятно, играет роль в стабильности и точности полимеразы благодаря взаимодействию с другими доменами.

Рис. 9.20   Тройные комплексы полимераз α, δ, ε и RB69 gp43 проиллюстрированы с одинаковой ориентацией для сравнения . Домены большого пальца (зеленый) и пальцев (темно-синий) захватывают дуплексную нуклеиновую кислоту (праймер показан бежевым цветом, шаблон — оранжевым) против домена ладони (красный). N-концевой домен появляется в золоте, рядом с 3′-5′-экзонуклеазным доменом (голубой). (A)  Полимераза α (PDBID 4FYD) связывает гибрид РНК/ДНК, где широкая неглубокая малая бороздка ДНК А-формы видна возле большого пальца.3′-5′-экзонуклеазный домен лишен активности. Спиральная область (пурпурный цвет) в домене инактивированной экзонуклеазы стабилизирует 5′-конец матрицы. (B)  Полимераза δ (PDBID 3IAY) содержит мотив большой β-шпильки (пурпурный), который важен для переключения цепи праймера с активного сайта полимеразы на активный сайт экзонуклеазы в случае корректуры. (C)  Полимераза ε (PDBID 4M8O) содержит уникальный P-домен (фиолетовый), который придает полимеразе повышенную процессивность.Интересно, что мотив шпильки β атрофирован в pol ε. (D)  Сохранение укладки ДНК-полимеразы семейства B и организации домена становится очевидным, когда модель фермента из бактериофага RB69 gp43 (PDBID 2OZS) рассматривается вместе с тремя эукариотическими репликативными полимеразами. Разграничение доменов для каждой полимеразы приведено в таблице S1. Рисунок был сделан с помощью PyMOL (Система молекулярной графики PyMOL, версия 1.5.0.4 Schrödinger, LLC.)

Рисунок из: Doublié, S.и Зан, К.Е. (2014) Фронт. Микробиол 5:444


ДНК-полимеразам требуются дополнительные факторы для поддержки репликации ДНК in vivo. ДНК-полимеразы имеют полузакрытую структуру, что позволяет им загружаться на ДНК и транслоцироваться. Эта структура позволяет ДНК-полимеразе удерживать одноцепочечную матрицу, включать dNTP в активный центр и высвобождать вновь образованную двойную цепь. Однако конформация ДНК-полимераз не позволяет им стабильно взаимодействовать с матричной ДНК.Чтобы усилить взаимодействие между матрицей и полимеразой, были разработаны скользящие зажимы ДНК, способствующие процессивности репликативных полимераз. У эукариот этот скользящий зажим представляет собой гомотример, известный как ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), , который образует кольцевую структуру. Кольцо PCNA имеет полярность с поверхностью, которая взаимодействует с ДНК-полимеразами и надежно привязывает их к ДНК. PCNA-зависимая стабилизация ДНК-полимераз оказывает значительное влияние на репликацию ДНК, поскольку она увеличивает процессивность полимеразы до 1000 раз (рис. 9.19).

D геликазы NA (белки MCM) и полимеразы также должны оставаться в тесном контакте на репликационной вилке (рис. 9.19). Если раскручивание происходит слишком далеко до синтеза, обнажаются большие участки одноцепочечной ДНК. Это может активировать передачу сигналов о повреждении ДНК или вызвать аберрантные процессы репарации ДНК. Чтобы предотвратить эти проблемы, эукариотическая реплисома содержит специализированные белки, предназначенные для регуляции активности хеликазы перед вилкой репликации.Эти белки также обеспечивают стыковочные сайты для физического взаимодействия между геликазами и полимеразами, тем самым гарантируя, что раскручивание дуплекса связано с синтезом ДНК.

Контроль происхождения обжига Использование

Origin у эукариот может быть динамичным, при этом Origin активируется в разных местах в зависимости от типа клеток и стадии развития. Тем не менее, механизм сборки реплисом и возбуждения ориджина в высокой степени консервативен. Во время позднего митоза и фазы G 1 белки клеточного цикла, такие как Cdc6, связываются с сайтами Ori по всему геному и рекрутируют ферменты геликазы, MCM 2-7 (рис. 9.21А). В это время двойные гексамеры комплекса MCM2-7 загружаются в местах начала репликации. Это генерирует пререпликационный комплекс (pre-RC) . Истоки со связанным pre-RC считаются лицензированными для репликации. Затем лицензированные источники репликации могут быть «запущены», когда репликация фактически инициируется на Ori. Активация источника вызывается множественными событиями фосфорилирования, осуществляемыми комплексом циклин E-CDK2 в начале S-фазы и другими циклин-зависимыми киназами (CDK) до активации индивидуального источника (рис. 9.21В). Циклинзависимые киназы  ( CDK ) — это семейства протеинкиназ , впервые обнаруженные в связи с их ролью в регуляции клеточного цикла. Они также участвуют в регуляции транскрипции, процессинга мРНК и дифференцировки нервных клеток. CDK активируются за счет связывания ассоциированного регуляторного белка циклина. Без циклина CDK проявляют небольшую киназную активность. После фосфорилирования пре-RC происходит плавление ориджина и раскручивание ДНК геликазой образует одноцепочечную ДНК, открывая матрицу для репликации (рис. 9.21С). Затем начинает формироваться реплисома с локализацией реплисомных факторов, таких как Cdc45. Синтез ДНК начинается на расплавленной матрице, и механизм репликации перемещается от источника двунаправленным образом.

Рис. 9.21 MCM2-7 загружается в ДНК в точках начала репликации во время G1 и раскручивает ДНК перед репликативными полимеразами. ( A ) Совместная активность Cdc6 и Cdt1 приводит комплексы MCM (показаны синими кругами разных оттенков) к местам начала репликации.( B ) CDK/DDK-зависимое фосфорилирование пре-RC компонентов приводит к сборке реплисом и запуску ориджина. Cdc6 и Cdt1 больше не требуются и удаляются из ядра или подвергаются деградации ( C ). На этом этапе сборка реплисом может быть завершена и инициирована репликация. «P» указывает на фосфорилирование.

Рисунок из: Lemanm A.R. и Ногучи, Э. (2013) Гены 4(1):1-32

Вернуться к началу
Репликация через нуклеосомы

Геномы эукариот существенно сложнее, чем меньшие по размеру и ничем не украшенные геномы прокариот.Эукариотические клетки имеют несколько несмежных компонентов ДНК, хромосом, каждая из которых должна быть уплотнена, чтобы обеспечить возможность упаковки в ограниченном пространстве ядра. Как видно из главы 4, хромосомы упаковываются путем намотки ~147 нуклеотидов (с интервалами в среднем 200 нуклеотидов) вокруг октамера гистоновых белков, образуя нуклеосому . Октамер гистонов включает по две копии каждого гистона h3A, h3B, h4 и h5. В главе 8 было подчеркнуто, что гистоновые белки подвергаются множеству посттрансляционных модификаций, включая фосфорилирование, ацетилирование, метилирование и убиквитинирование, которые представляют собой жизненно важные эпигенетические метки.Тесная ассоциация гистоновых белков с ДНК в нуклеосомах предполагает, что эукариотические клетки обладают белками, предназначенными для ремоделирования гистонов перед вилкой репликации, чтобы обеспечить плавное продвижение реплисомы. Также важно повторно собрать гистоны за разветвлением, чтобы восстановить конформацию нуклеосомы. Кроме того, важно передать эпигенетическую информацию, обнаруженную на родительских нуклеосомах, дочерним нуклеосомам, чтобы сохранить то же самое состояние хроматина.Другими словами, на дочерних нуклеосомах должны присутствовать те же модификации гистонов, что и на родительских нуклеосомах. Все это должно быть сделано при удвоении количества хроматина, что требует включения вновь синтезированных гистоновых белков. Этот процесс осуществляется с помощью шаперонов гистонов и ремодулеров гистонов , которые обсуждаются ниже (рис. 9.22).

Рис. 9.22 Смещение и отложение нуклеосом во время репликации ДНК. Гистоны удаляются из хроматина перед репликационной вилкой. FACT может облегчить этот процесс. Asf1 рекрутирует димеры гистонов h4-h5 в репликационную вилку. CAF-1 и Rtt106 загружают вновь синтезированные (светло-фиолетовые) гистоны, чтобы установить хроматин за разветвлением. Ранее загруженные гистоны (темно-фиолетовые) также откладываются на обеих дочерних цепях ДНК. Гистоновые шапероны, участвующие в этих процессах, связаны с белками реплисом: CAF-1/Rtt106 с PCNA и FACT/Asf1 с MCM.

Рисунок из: Lemanm A.R. и Ногучи, Э. (2013) Гены 4(1):1-32


Известно, что несколько гистоновых шаперонов участвуют в сборке нуклеосом, связанных с репликацией, включая комплекс FACT . Компоненты комплекса FACT первоначально были идентифицированы как белки, сильно стимулирующие транскрипцию РНК-полимеразой II. Было обнаружено, что у почкующихся дрожжей FACT взаимодействует с комплексом ДНК Pol α-primase, а субъединицы FACT генетически взаимодействуют с факторами репликации.Совсем недавно исследования показали, что FACT облегчает репликацию ДНК in vivo и связан с реплисомами в почкующихся дрожжевых клетках и клетках человека. Комплекс FACT представляет собой гетеродимер, который не гидролизует АТФ, но способствует «разрыхлению» гистонов в нуклеосомах

Барьеры вилки репликации и прекращение репликации

У прокариот, таких как E. coli , двунаправленная репликация инициируется в одном месте начала репликации на кольцевой хромосоме и заканчивается в сайте, приблизительно противоположном месту начала.Эта область терминатора репликации содержит последовательности ДНК, известные как сайты Ter , полярные терминаторы репликации, которые связаны с белком Tus. Комплекс Ter -Tus противодействует активности геликазы, что приводит к терминации репликации. Таким образом, вилки репликации прокариот останавливаются и заканчиваются предсказуемым образом во время каждого раунда репликации ДНК.

У эукариот ситуация иная. Прекращение репликации обычно происходит при столкновении двух вилок репликации где-то между двумя активными источниками репликации.Место столкновения может варьироваться в зависимости от скорости репликации каждой из вилок и времени срабатывания источника. Часто, если репликационная вилка останавливается или разрушается на определенном сайте, репликация сайта может быть восстановлена, когда реплисома, движущаяся в противоположном направлении, завершает копирование региона. Однако существует множество запрограммированных барьеров репликационной вилки (RFB) и репликационных «проблем» по всему геному. Чтобы эффективно завершить или приостановить вилки репликации, некоторые барьеры вилки связываются белками RFB способом, аналогичным E.coli Тус. В этих обстоятельствах реплисома и белки RFB должны специфически взаимодействовать, чтобы остановить развитие вилки репликации.

Вернуться к началу

9.5 Репликация митохондриальной ДНК

Митохондрии млекопитающих содержат несколько копий кольцевого двухцепочечного генома ДНК длиной примерно 16,6 т.п.н. (рис. 9.23). Две нити мтДНК различаются по своему основному составу, одна из них богата гуанинами, что позволяет разделить тяжелую (H) и легкую (L) нити с помощью центрифугирования в плотности.МтДНК содержит одну более длинную некодирующую область (NCR) , также называемую контрольной областью. В NCR имеются промоторы для полицистронной транскрипции, по одному на каждую цепь мтДНК; промотор легкой цепи (LSP) и промотор тяжелой цепи (HSP). NCR также содержит начало репликации H-цепи ДНК (O H ). Второе начало репликации L-цепи ДНК (O L ) расположено вне NCR, внутри кластера тРНК.

Рис. 9.23 Карта мтДНК человека. Геном кодирует 13 молекул мРНК (зеленые), 22 молекулы тРНК (фиолетовые) и 2 молекулы рРНК (бледно-голубые). Существует также основная некодирующая область (NCR), которая показана увеличенной вверху синим цветом. Основной NCR содержит промотор тяжелой цепи (HSP), промотор легкой цепи (LSP), три блока консервативных последовательностей (CSB1-3, оранжевый), точку начала репликации H-цепи (O H ) и терминатор- связанная последовательность (TAS, желтый). Структура трехцепочечной петли смещения (D-петля) образуется за счет преждевременного прекращения синтеза зарождающейся Н-цепи ДНК в TAS.Образовавшийся таким образом продукт репликации короткой H-цепи называется 7S ДНК. Минорный NCR, расположенный приблизительно на 11000 п.н. ниже O H , содержит точку начала репликации L-цепи (O L ).

Рисунок из: Falkenberg, M. (2018) Essays Biochem 62(3):287-296


Для его обслуживания требуется специальный механизм репликации ДНК. МтДНК млекопитающих реплицируется белками, отличными от тех, которые используются для репликации ядерной ДНК, и многие из них связаны с факторами репликации, идентифицированными у бактериофагов.ДНК-полимераза γ (POLγ) является репликативной полимеразой в митохондриях. В клетках человека POLγ представляет собой гетеротример с одной каталитической субъединицей (POLγA) и двумя вспомогательными субъединицами (POLγB). POLγA принадлежит к семейству ДНК-полимераз А и содержит 3′-5′-экзонуклеазный домен, который корректирует вновь синтезированную цепь ДНК. POLγ представляет собой высокоточную ДНК-полимеразу с частотой неправильного включения менее 1 × 10 -6 . Дополнительная субъединица POLγB усиливает взаимодействие с матрицей ДНК и увеличивает как каталитическую активность, так и процессивность POLγA.ДНК-геликаза TWINKLE движется перед POLγ, раскручивая двухцепочечную ДНК-матрицу. TWINKLE образует гексамер и требует вилочной структуры (сайт загрузки одноцепочечной 5′-ДНК и короткий 3′-хвост) для загрузки и инициации раскручивания. Митохондриальный одноцепочечный ДНК-связывающий белок (mtSSB) связывается с образовавшейся одноцепочечной ДНК, защищает ее от действия нуклеаз и препятствует образованию вторичной структуры

Наиболее распространенной моделью репликации ДНК в митохондриях является модель смещения нити (рис. 9.24) . В этой модели синтез ДНК происходит непрерывно как на H-, так и на L-цепи. Для каждой нити существует специальное происхождение: O H  и O L . Во-первых, репликация инициируется в O H  , а затем продолжается синтез ДНК с образованием новой H-цепи. Во время начальной фазы не происходит одновременного синтеза L-цепи, и mtSSB покрывает смещенную родительскую H-цепь. Связываясь с одноцепочечной ДНК, mtSSB не позволяет митохондриальной РНК-полимеразе (POLRMT) инициировать случайный синтез РНК на смещенной цепи.Когда репликационная вилка проходит около двух третей генома, она проходит второе начало репликации, O L . При экспонировании в одноцепочечной конформации исходная Н-цепь в O L складывается в структуру «стебель-петля». Стебель эффективно блокирует связывание mtSSB, поэтому короткий участок одноцепочечной ДНК в области петли остается доступным, что позволяет POLRMT инициировать синтез РНК. POLRMT не является процессивным на матрицах одноцепочечной ДНК.После добавления примерно 25 нуклеотидов он заменяется на POLγ и инициируется синтез L-цепи ДНК. С этого момента синтез H- и L-цепей продолжается непрерывно, пока две нити не достигнут полного цикла. Репликация двух цепей связана, поскольку для инициации синтеза L-цепи требуется синтез H-цепи. ДНК-лигаза III используется для завершения лигирования вновь образованных цепей ДНК.

Во время репликации ДНК родительская молекула остается интактной, что создает стерическую проблему для движущегося механизма репликации.Топоизомеразы, принадлежащие к семейству 1-го типа, могут снимать возникающую таким образом деформацию кручения, позволяя одной из тяжей проходить через другую. В митохондриях млекопитающих фермент TOP1MT типа IB может действовать как «шарнир» ДНК, работая вместе с митохондриальной реплисомой. Кроме того, репликация кольцевой ДНК часто вызывает образование катенанов или переплетенных колец, которые необходимо отделить друг от друга. Топоизомераза типа 1А, топоизомераза 3α (Top3α), необходима для разрешения гемикатенановой структуры, которая может образовываться во время репликации мтДНК.

Рис. 9.24 Репликация митохондриального генома человека. Репликация митохондриальной ДНК инициируется в O H и протекает в одном направлении с образованием полноразмерной зарождающейся H-цепи. mtSSB связывает и защищает открытую родительскую H-цепь. Когда реплисома проходит O L , формируется структура стебель-петля, которая блокирует связывание mtSSB, представляя собой одноцепочечную петлевую область, из которой POLRMT может инициировать синтез праймера. Переход к синтезу L-цепи ДНК происходит примерно через 25 н., когда POLγ заменяет POLRMT на 3′-конце праймера.Синтез двух цепей происходит непрерывно до тех пор, пока не будут образованы две полные двухцепочечные молекулы ДНК.

Рисунок из: Falkenberg, M. (2018) Essays Biochem 62(3):287-296


Любопытно, что не все события репликации, инициированные в O H , продолжаются по кругу. Вместо этого 95% терминируются примерно после первых 650 нуклеотидов в последовательности, известной как связанных с терминацией последовательностей (TAS) (рис. 9.23). Это создает короткий фрагмент ДНК, известный как ДНК 7S, который остается связанным с родительской L-цепью, в то время как родительская H-цепь смещается (рис. 9.23). В результате образуется трехцепочечная структура петли смещения , D-петля . Функциональная важность структуры D-петли неясна, и то, как репликация завершается в TAS, также неизвестно.

Вернуться к началу

9.6 Теломеры и репликативное старение
Проблема конечной репликации

У человека теломеры состоят из сотен и тысяч повторяющихся последовательностей TTAGGG на концах хромосом для поддержания целостности генома.Поскольку репликация ДНК асимметрична вдоль двойных цепей, последовательность РНК-пимера на 3′-гидроксильном конце не может быть заменена ДНК-полимеразой I, поскольку для полимеразы отсутствует праймерная группа 3′-ОН для удлинения цепи ДНК. Это приводит к потере 30–200 нуклеотидов при каждой репликации ДНК и делении клетки и известно как проблема конечной репликации . Теломеры содержат повторяющуюся некодирующую последовательность ДНК на 3′-конце для предотвращения потери важной генетически кодируемой информации во время репликации.Более того, теломеры покрыты комплексом из шести кэпирующих белков, также известных как шелтериновые белки , которые упакованы в компактную Т-образную структуру   , скрывающую концы хромосом. Это препятствует тому, чтобы механизмы репарации ДНК ошибочно принимали хромосомные концы за двухцепочечные разрывы ДНК (рис. 9.25). Поэтому теломеры были предложены в качестве митотических часов , которые измеряют, сколько раз клетка делилась, и, по сути, дают клетке определенное время жизни.

Рис. 9.25 Структура теломер. (A) Теломеры расположены на концах хромосом, где они помогают защитить ДНК от потери во время репликации. (B) квадруплекс ДНК, образованный повторами теломер. Петельчатая конформация остова ДНК сильно отличается от типичной спирали ДНК, она известна как образование Т-петли . Зеленые сферы в центре представляют собой ионы калия.

Изображение (A) предоставлено: MBInfo и изображение (B) предоставлено:  Thomas Splettstoesser


Фермент теломеразы человека отвечает за поддержание и удлинение теломер и состоит из РНК-компонента (TERC) и обратной транскриптазы (TERT) , которая 9.26). TERT использует TERC в качестве матрицы для синтеза новых повторов теломерной ДНК на одноцепочечном конце для поддержания длины теломер (рис. 9.26). Некоторые клетки, такие как зародышевые клетки, стволовые клетки, гемопоэтические клетки-предшественники, активированные лимфоциты и большинство раковых клеток, конститутивно экспрессируют теломеразу и поддерживают активность теломеразы для преодоления укорочения теломер и клеточного старения. Однако большинство других соматических клеток обычно имеют низкий или неопределяемый уровень теломеразной активности и, как следствие, ограниченную продолжительность жизни.Интересно, что общая активность теломеразы снижается с возрастом, но заметно возрастает в ответ на травму, что указывает на роль теломеразы в клеточной регенерации во время заживления ран. Длина и целостность теломер регулируются посредством взаимодействия между белками теломеразы и шелтерина .

Рис. 9.26 Концептуальная модель активности теломеразы. Активный центр фермента теломеразы содержит матрицу РНК, TERC (показан красным) и выравнивается с несколькими последними основаниями теломер на конце хромосомы (показаны синим цветом).Это создает одноцепочечный выступ, который может использоваться обратной транскриптазой TERT в качестве матрицы для удлинения последовательности теломер.

Рисунок: Abbexa Ltd.


In vivo, укороченные теломеры и поврежденные теломеры, обычно вызываемые активными формами кислорода (АФК), обычно считаются основными маркерами клеточного старения и считаются основной причиной репликативного старения . I n vitro , теломеры теряют приблизительно 50–200 п.н. при каждом делении из-за проблемы репликации концов.Приблизительно 100 митозов считаются достаточными для достижения предела Хейфлика , или максимального количества митотических событий, разрешенных до начала репликативного старения. Постоянно обновляющиеся клетки, такие как клетки крови, компенсируют эрозию теломер за счет экспрессии теломеразы, единственного фермента, способного полимеризовать теломерные последовательности de novo на концах теломер. Выключение компонентов теломеразы, таких как каталитическая субъединица (TERT) или матрица РНК (TERC), вызывает несколько особенностей старения у мышей.У людей мутации зародышевой линии в субъединицах теломеразы ответственны за прогероидные синдромы, такие как врожденный дискератоз, редкая генетическая форма недостаточности костного мозга. Кроме того, продолжительность здоровой жизни у людей положительно коррелирует с большей длиной теломер, а у пациентов, страдающих возрастными заболеваниями и преждевременным старением, теломеры короче, чем у здоровых людей. Было также показано, что накопление невосстановленных повреждений в теломерных областях накапливается у стареющих мышей и нечеловеческих приматов, что позволяет предположить, что повреждение теломер с возрастом также может способствовать возрастным болезненным состояниям и сокращению продолжительности жизни.

Таким образом, можно утверждать, что активация и экспрессия теломеразы могут быть способом снижения возрастных заболеваний и увеличения общей продолжительности жизни. Однако конститутивная экспрессия теломеразы, к сожалению, характерна почти для всех раковых клеток. Поэтому неудивительно, что у трансгенных животных со сверхэкспрессией каталитической субъединицы теломеразы (mTERT) в более раннем возрасте развивается рак. Однако сверхэкспрессия теломеразы у мышей с высокой устойчивостью к раку показала значительное увеличение средней продолжительности жизни и значительное снижение возрастных расстройств.Поскольку люди не обладают высокой устойчивостью к раку, это неприемлемо для людей. Однако дополнительные исследования на мышах, где конститутивная экспрессия теломеразы была введена только в небольшой процент клеток-хозяев с использованием методов генной терапии аденовирусов, дали более многообещающие результаты. Аденовирусы представляют собой группу вирусов, которые образуют икосаэдрический белковый капсид, содержащий линейный двухцепочечный геном ДНК. Инфекции у людей обычно вызывают симптомы простуды и обычно носят легкий характер.Они являются хорошей мишенью для генной терапии, поскольку ДНК, которую они несут, может мутировать, так что они теряют способность к репликации после заражения хозяина. Их также можно трансформировать для переноса интересующего гена в хозяина, где этот ген затем может интегрироваться в геном хозяина. Эксперименты на мышах, инфицированных аденовирусом, несущим ген mTERT, показали, что mTERT доставляется в широкий спектр тканей организма и увеличивает длину теломер в этих тканях.Кроме того, мыши, экспрессирующие mTERT, были здоровее, чем их однопометники, и у них наблюдалось снижение инвалидизирующих состояний, связанных с физиологическим старением, таких как остеопороз и резистентность к инсулину (рис. 9.27). Когнитивные навыки и метаболические функции также улучшились. Примечательно, что у мышей, получавших генную терапию, не было повышенного уровня заболеваемости раком, что позволяет предположить, что, по крайней мере, у короткоживущих видов мышей подход генной терапии к повышению активности теломеразы безопасен.Среди этих животных средняя продолжительность жизни увеличилась на 24%, если животных лечили в возрасте 1 года, и на 13%, если лечили в возрасте 2 лет.

Рис. 9.27 Повышение продолжительности жизни у мышей с помощью теломеразной генной терапии. Доставка каталитической субъединицы теломеразы (TERT) с использованием модифицированного аденовирусного вектора (rAAV) подавляет эрозию теломер, связанную со старением, и удлиняет короткие теломеры в различных тканях. Следовательно, у животных улучшается продолжительность жизни и увеличивается продолжительность жизни.

Рисунок из: Boccardi, V. and Herbig, U. (2012) EMBO Mol Med 4:685-687.


Репликация и восстановление последовательностей теломер

В дополнение к проблеме репликации концов, репликация и репарация теломерной ДНК (telDNA) представляет собой реальную проблему из-за различных структурных особенностей теломер. Во-первых, сама нуклеотидная последовательность состоит из гексануклеотидного мотива (TTAGGG), повторяющегося в тысячах оснований, причем цепочка 5′-3′ называется «G-цепью» из-за высокого содержания в ней гуанина.Во время развития репликационной вилки отстающая цепь, соответствующая G-цепи, образует структуры G-квадруплекса (G4), которые должны быть разрешены, чтобы обеспечить развитие вилки и завершить репликацию (рис. 9.28а). Во-вторых, R-петли, соответствующие высокостабильным гибридам РНК:ДНК, включающие длинный некодирующий теломерный транскрипт TERRA (теломерный повтор, содержащий РНК), также должны быть диссоциированы. В-третьих, концы теломер имеют специфическую петлевую структуру, Т-образную петлю, которую необходимо распутать.Это петля, которая скрывает двухцепочечный конец от датчиков повреждения ДНК и блокируется гибридизацией выступающего конца 3′-цепи с вышеупомянутой 3′-5′-цепью, тем самым замещая соответствующую 5′-3′-цепь. чтобы сформировать структуру D-петли (петли смещения) (рис. 9.28а). Наконец, репликация также должна иметь дело с барьерами, встречающимися в других частях генома, такими как торсионы и конденсированное гетерохроматиновое окружение.

Рисунок 9.28. Препятствия и решения для репликации теломер. (a) Изображена теломерная последовательность с G-цепью, отмеченной сплошной красной линией, и C-цепью, обозначенной сплошной зеленой линией. Конечная D-петля, структурирующая гораздо большую Т-петлю, стабилизируется комплексом шелтерина. Реплисома (PCNA, pol ε и т. д.) полимеризует новую G-цепь (обозначенную красной пунктирной линией) и освобождает исходную G-цепь, обеспечивая образование вторичной структуры G4. Также показаны R-петли, соответствующие гибридизации TERRA (черные пунктирные линии) с цепью 3′-5′, и перекруты из-за развития вилки.(b) Изображены помощники репликации, такие как хеликазы, помогающие либо в раскручивании G4, либо в разблокировке D-петли. ДНКазы (Top2a, DNA2) и РНКазы (RNAse h2 и FEN1) помогают в разрешении торсионов и гетеродуплексов РНК:ДНК, в то время как Timeless стимулирует реплисому, а POT1 конкурирует с RPA1 за связывание одноцепочечной цепи и помогает в растворении G4. Компоненты шелтерина, POT1, TRF1 и TRF2 помогают в загрузке вспомогательных белков (тонкие зеленые стрелки)

Рисунок из: Billiard, P. and Poncet, D.А. (2019) Int J. Mol. науч. 20(19) 4959


Поскольку теломеры сталкиваются с множеством препятствий для завершения процесса репликации, как показано на рис. 9.28, клетка обладает набором специализированных механизмов для полного выполнения репликации, таких как белки RTEL1, TRF1 и TRF2, ДНКазы, РНК, и вне времени. Рекрутирование этих факторов организовано шелтериновым комплексом.

На молекулярном уровне теломерные повторы GGG особенно чувствительны к АФК, которые производят участки 8-оксогуанина, которые особенно трудно репарировать.В сочетании с неэффективной репарацией теломер эти АФК-индуцированные повреждения вызывают одно- и двухцепочечные разрывы и/или генерируют репликативный стресс, что в конечном итоге приводит к укорочению теломер. Присутствие нерепарированного одиночного или тандемного 8-оксогуанина резко ингибирует связывание TRF1 и TRF2 и нарушает рекрутирование теломеразы, особенно когда повреждение АФК локализовано в 3′-выступе. Этот тип повреждения способствует снятию защиты и укорочению теломер. Поразительно, АФК (и другие метаболические стрессы) также индуцируют перемещение TERT в митохондрии, как это наблюдается (i) в первичных нейронах после окислительного стресса; (ii) в нейронах, подвергшихся воздействию тау-белка; (iii) в нейронах Пуркинье, подвергшихся эксайтотоксичности; и (iv) в линиях раковых клеток, обработанных лигандом G4.Митохондриальный TERT увеличивает потенциал внутренней мембраны, а также количество копий мтДНК и снижает продукцию АФК с защитным действием на мтДНК. Митохондрии также являются важными сенсорами клеточных повреждений и участвуют в процессах аутофагии и апоптоза (запрограммированной гибели клеток). Перемещение TERT после хромосомного повреждения в ядре может указывать на один механизм, который митохондрии используют для мониторинга клеточного стресса и повреждения.

Вернуться к началу
Освоение контента

Какой из перечисленных ферментов заменяет нуклеотиды РНК в праймере нуклеотидами ДНК?

  1. ДНК-полимераза III
  2. ДНК-полимераза I
  3. примас
  4. спираль

[reveal-answer q=»628075″]Показать ответ[/reveal-answer]
[скрытый-answer a=»628075″]Ответ b.ДНК-полимераза I – это фермент, который заменяет нуклеотиды РНК в праймере нуклеотидами ДНК.[/hidden-answer]

Что из перечисленного ниже не участвует в инициации репликации?

  1. лигаза
  2. ДНК-гираза
  3. одноцепочечный связывающий белок
  4. примас

[reveal-answer q=»820951″]Показать ответ[/reveal-answer]
[скрытый-answer a=»820951″]Ответ a. Лигаза не участвует в инициации репликации.[/hidden-answer]

Какой из следующих ферментов, участвующих в репликации ДНК, уникален для эукариот?

  1. спираль
  2. ДНК-полимераза
  3. лигаза
  4. теломераза

[reveal-answer q=»650146″]Показать ответ[/reveal-answer]
[скрытый-answer a=»650146″]Ответ d.Теломераза уникальна для эукариот.[/hidden-answer]

Что из следующего может быть синтезировано с использованием 5′-CAGTTCGGA-3′ в качестве матрицы?

  1. 3′-АГГКТТГАЦ-4′
  2. 3′-TCCGAACTG-5′
  3. 3′-GTCAAGCCT-5′
  4. 3′-КАГТЦГГА-5′

[reveal-answer q=»429167″]Показать ответ[/reveal-answer]
[скрытый-answer a=»429167″]Ответ c. 3′-GTCAAGCCT-5′[/скрытый ответ]

Фермент, отвечающий за релаксацию сверхскрученной ДНК, что позволяет инициировать репликацию, называется ________.
[reveal-answer q=”855893″]Показать ответ[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”855893″]Фермент, отвечающий за релаксацию сверхскрученной ДНК для обеспечения инициации репликации, называется ДНК-гиразой или топоизомераза II .[/hidden-answer]

Однонаправленная репликация кольцевой молекулы ДНК, такой как плазмида, которая включает разрыв одной цепи ДНК и ее смещение при синтезе новой цепи, называется ________.
[reveal-answer q=”378861″]Показать ответ[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”378861″]Однонаправленная репликация кольцевой молекулы ДНК, подобной плазмиде, которая включает надрез одной цепи ДНК и ее смещение во время синтез новой нити называется репликацией по катящемуся кругу .[/скрытый ответ]

При синтезе отстающей цепи используется больше праймеров, чем при синтезе лидирующей цепи.
[reveal-answer q=”25479″]Показать ответ[/reveal-answer]
[hidden-answer a=”25479″]True[/hidden-answer]

  1. Почему для репликации ДНК требуется праймаза?
  2. Какова роль одноцепочечного связывающего белка в репликации ДНК?
  3. Ниже представлена ​​последовательность ДНК. Представьте, что это часть молекулы ДНК, которая отделилась при подготовке к репликации, поэтому вы видите только одну цепь ДНК.Создайте комплементарную последовательность ДНК (с указанием 5′- и 3′-концов). Последовательность ДНК: 3′-T A C T G A C T G A C G A T C-5′
  4. Обзор рис. 1 и рис. 2. Почему было важно, чтобы Мезельсон и Шталь продолжили свой эксперимент как минимум до двух циклов репликации после изотопного мечения исходной ДНК с помощью 15 Н вместо того, чтобы останавливать эксперимент только после одного раунда репликации ?
  5. Если в процессе репликации будут добавлены дезоксирибонуклеотиды, у которых отсутствуют 3′-ОН группы, что, по вашему мнению, произойдет?

Вернуться к началу


9.7 Каталожные номера
  1. Паркер, Н., Шнеегурт, М., Тхи Ту, А-Х., Листер, П., Форстер, Б.М. (2019) Микробиология. Опенстакс . Доступно по адресу: https://opentextbc.ca/microbiologyopenstax/
  2. .
  3. Принципы биохимии/клеточного метаболизма I: репликация ДНК. (2017, 6 августа). Викиучебники, Проект бесплатных учебников . Получено 19:07, 31 октября 2019 г., с https://en.wikibooks.org/w/index.php?title=Principles_of_Biochemistry/Cell_Metabolism_I:_DNA_replication&oldid=3259729.
  4. Кайзер, Г.Э. (2015) Анатомия прокариотических клеток. Общественный колледж округа Балтимор. Доступно по адресу: http://faculty.ccbcmd.edu/~gkaiser/SoftChalk%20BIOL%20230/Prokaryotic%20Cell%20Anatomy/nucleoid/nucleoid/nucleoid3.html
  5. RCSB PDB «Молекула месяца»: вдохновляющий молекулярный взгляд на биологию Д.С. Гудселл, С. Датта, К. Зардеки, М. Фойгт, Х.М. Берман, С.К. Burley (2015) PLoS Biol 13 (5): e1002140. doi: 10.1371/journal.pbio.1002140
  6. участников Википедии.(2020, 7 мая). Геликаза. В Wikipedia, The Free Encyclopedia . Получено 13:38, 9 июня 2020 г., с https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Helicase&oldid=955303097
  7. .
  8. Виндгассен Т.А., Вессель С.Р., Бхаттачария Б. и Кек Дж.Л. (2017) Механизмы перезапуска репликации бактериальной ДНК. Nuc Acids Res 46(2):504-519. Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5778457/
  9. .
  10. Сюй, Z-Q., Диксон, NE (2018) Бактериальные реплисомы. Curr Opin Struct Biol 53:159-168.Доступно по адресу: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X18300952
  11. .
  12. Лю, Б., Элиасон, В.К., и Стейц, Т.А. (2013)Структура комплекса геликаза-геликазный загрузчик раскрывает понимание механизма сборки бактериальных примосом. Сообщение о природе 4:2495. Доступно по адресу: https://www.researchgate.net/publication/256764134_Structure_of_a_helicase-helicase_loader_complex_reveals_insights_into_the_mechanism_of_bacterial_primosome_assembly
  13. .
  14. Сюй, Z-Q., и Диксон, NE(2018) Бактериальные реплисомы. Curr Op Struc Biol 53:159-168. Доступно по адресу: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X18300952
  15. .
  16. Фернандес-Лейро, Р., Конрад, Дж., Шерес, С.Х.В., и Ламерс, М.Х. (2015) крио-ЭМ структуры репликативной ДНК-полимеразы E. coli обнаруживают ее динамические взаимодействия со скользящим зажимом ДНК, экзонуклеазой и τ. eLife 4:e11134. Доступно по адресу: https://elifesciences.org/articles/11134
  17. .
  18. Экундайо, Б. и Блейхерт, Ф.(2019) Происхождение репликации ДНК. PLOS 15(12): e1008556. Доступно по адресу: https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1008320
  19. .
  20. Леман, А.Р., и Ногучи, Э. (2013) Репликационная вилка: понимание эукариотического механизма репликации и проблемы с дублированием генома. Гены 4(1): 1-32. Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3627427/
  21. .
  22. Дубли, С. и Зан, К.Е. (2014) Структурное понимание репликации эукариотической ДНК. Фронт. микробиол. 5:444. Доступно по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2014.00444/full
  23. .
  24. Биллард П. и Понсе Д.А. (2019) Стресс репликации в теломерной и митохондриальной ДНК: общие причины и последствия старения. Int J. Mol Sci 20(19):4959. Доступно по адресу: https://www.mdpi.com/1422-0067/20/19/4959/htm
  25. .
  26. Йе, Дж.-К., и Ван, К.-Ю. (2016) Теломеры и теломераза при сердечно-сосудистых заболеваниях. Гены 7(9)58. Доступно по адресу: https://www.mdpi.com/2073-4425/7/9/58/htm
  27. Боккарди В. и Хербиг У. (2012) Генная терапия теломерсами: новый подход к борьбе со старением. EMBO Mol Med 4:685-687. Доступно по адресу: https://www.embopress.org/doi/epdf/10.1002/emmm.201200246
  28. .
  29. участников Википедии. (2020, 26 апреля). Циклинзависимая киназа. В Wikipedia, The Free Encyclopedia . Получено 18:52, 30 июня 2020 г., с https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Cyclin-dependent_kinase&oldid=953307433
  30. .
  31. Фалькенберг, М.(2018) Репликация митохондриальной ДНК в клетках млекопитающих: обзор пути. Очерки Biochem 62 (3): 287-296. Доступно по адресу: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6056714/
  32. .
  33. Фолвер С. и др. др. (2013) Концепции биологии. Опенстакс. Доступно по ссылке: https://openstax.org/details/books/concepts-biology?Book%20details
  34. Алим Э. и Арсечи Р.Дж. (2015) Нацеливание на регуляторы клеточного цикла при гематологических злокачественных новообразованиях. Границы клеточной биологии и биологии развития 3 (16).Доступно по адресу: https://www.researchgate.net/publication/275354547_Targeting_cell_cycle_regulators_in_hematologic_malignancies
  35. .
Вернуться к началу .

Post A Comment

Ваш адрес email не будет опубликован.